Clonación Genética: Fundamentos y Metodología en Biotecnología Molecular

Introducción a la Clonación Genética

Clonar un gen es el proceso de hacer un conjunto de numerosas copias idénticas de un gen específico. Esta técnica fundamental en biología molecular permite estudiar la función de genes individuales, producir proteínas de interés y desarrollar terapias génicas.

Etapas Fundamentales de la Clonación de Genes

1. Aislamiento y Obtención del Gen de Interés: Identificación y extracción del fragmento de ADN que contiene el gen deseado.
2. Selección del Vector de Clonación: Elección de una molécula de ADN capaz de transportar y replicar el gen dentro de una célula hospedadora.
3. Formación de ADN Recombinante: Unión covalente del gen aislado con el vector de clonación.
4. Introducción del ADN Recombinante en una Célula Hospedadora: Transferencia del ADN recombinante a una célula viva donde pueda replicarse y expresarse.
5. Comprobación de la Expresión del Gen Clonado y Selección de las Células Hospedadoras: Verificación de que el gen se ha integrado y se expresa correctamente, y aislamiento de las células que lo contienen.

Las células hospedadoras pueden ser de diferentes tipos:

• Células Bacterianas: El gen unido al vector se introduce en bacterias. Al multiplicarse estas, se consigue un número elevado de copias de ese gen. Esta es la vía clásica de clonación.
• Células Eucariotas: El gen se une al vector de clonación apropiado y se introduce en células vegetales, animales o en levaduras.

Clonación Utilizando Células Bacterianas

1. Aislamiento y Obtención del Gen

Para clonar genes de organismos procariotas, el procedimiento habitual es cortar el ADN cromosómico en sitios concretos para obtener el gen que interesa. Esto se realiza mediante endonucleasas de restricción, enzimas que actúan como "tijeras moleculares". Muchos genes ya están aislados y disponibles en las genotecas (bibliotecas de ADN).

2. Selección del Vector de Clonación

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN que tienen la capacidad de autorreplicarse dentro de las células hospedadoras, independientemente de los cromosomas de estas. Habitualmente, se utilizan tres tipos principales de vectores:

• Plásmidos: Son moléculas de ADN circular, presentes en la mayoría de bacterias, de menor tamaño que el cromosoma bacteriano. Se replican con independencia del cromosoma, ya que poseen su propio origen de replicación.
• Genomas de Algunos Virus: Se trata de moléculas pequeñas de ADN que contienen su propio origen de replicación, como los bacteriófagos.
• Cromosomas Bacterianos Artificiales (BACs): Son plásmidos diseñados para la clonación de fragmentos muy grandes de ADN (formados por centenares de miles de pares de bases). Incluyen orígenes de replicación muy estables.

Además, los vectores de clonación deben portar otros genes, conocidos como marcadores, que permiten identificar rápida y fácilmente las células que contienen el vector de clonación (por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos).

3. Formación de una Molécula de ADN Recombinante

Esta etapa implica la unión covalente del gen a clonar con el vector de clonación. Esta unión se cataliza mediante la enzima ADN ligasa, lo que produce la molécula de ADN recombinante.

4. Introducción en la Célula Hospedadora

El ADN recombinante se introduce en una célula hospedadora, la cual proporciona la maquinaria replicativa necesaria para las moléculas recombinantes. Es crucial que la célula hospedadora pueda expresar el gen clonado y producir la proteína que este codifica. Las células hospedadoras ideales deben cumplir con ciertas características:

• Experimentar un crecimiento rápido.
• No ser patógenas o peligrosas.
• Ser capaces de captar o tomar moléculas de ADN del medio externo e incorporarlas en su genoma.

Existen varios métodos para introducir ADN en células vivas:

• Transformación: Se utiliza principalmente en células procariotas. La célula capta las moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma mediante recombinación.
• Transducción: Consiste en introducir ADN en la célula hospedadora utilizando como vector de clonación el genoma de un virus bacteriófago.

5. Comprobación de la Expresión del Gen Clonado y Selección de las Células Hospedadoras

Si los genes clonados son de origen bacteriano, pueden expresarse directamente en la bacteria hospedadora, ya que la maquinaria de transcripción y traducción es semejante. Para genes eucariotas clonados en bacterias, los vectores de clonación deben incluir secuencias reguladoras de transcripción y traducción adecuadas para la expresión génica en procariotas; estos vectores se denominan frecuentemente vectores de expresión.

Métodos de Detección del Producto de Algunos Genes Clonados:

• Genes Marcadores: El vector de clonación lleva genes marcadores de fácil detección fenotípica, generalmente de resistencia a antibióticos. Las colonias bacterianas que son resistentes a los antibióticos marcadores lo son porque han incorporado el vector y, por lo tanto, también el gen deseado.
• Sondas Radiactivas: También se puede detectar el gen mediante una sonda radiactiva, que es una cadena de ADN marcada radiactivamente y complementaria de una de las hebras del gen clonado. Esta sonda hibridará con el gen clonado, pudiendo detectarse su presencia por autorradiografía.