Estrategias de selección en clonación molecular y bibliotecas de ADN

Estrategias de Selección e Identificación en Clonación Molecular

1. Estrategia de Resistencia a Antibióticos (ATB)

• Genes de resistencia a ATB: Se utilizan dos genes de resistencia a antibióticos, por ejemplo, ampicilina y tetraciclina.
• El punto de inserción del ADN extraño se encuentra en el interior de la secuencia de uno de los genes de resistencia (ej., tetraciclina).
• En vectores recombinantes, el gen de resistencia a tetraciclina no es funcional, ya que su secuencia es interrumpida por el inserto.
• Células no transformadas: Sensibles a ambos antibióticos.
• Células transformadas con vector recombinante: Resistentes a ampicilina y sensibles a tetraciclina.
• Células transformadas con el vector no recombinante: Resistentes a ambos antibióticos (ampicilina y tetraciclina).

Proceso de Selección e Identificación:

• Selección: Cultivar las células en un medio que contenga ampicilina. Solo crecerán las células transformadas (con vector recombinante o no recombinante).
• Identificación: Replicar la placa en un medio que contenga tetraciclina. Solo crecerán las bacterias transformadas con el vector no recombinante (resistentes a tetraciclina). Las colonias que no crecen en tetraciclina pero sí en ampicilina son las que contienen el vector recombinante.

2. Estrategia Cromogénica (Alfa-Complementación)

• Se basa en la inactivación de un gen reportero, generalmente el gen LacZ.
• Vectores: Contienen un gen de resistencia a antibióticos (para selección) y el gen LacZα con un polylinker (para identificación).
• Células no transformadas: Sensibles al ATB y Lac-.
• Células transformadas con vector recombinante: Resistentes al ATB y Lac- (debido a la interrupción del gen LacZα por el inserto).
• Células transformadas con vector no recombinante: Resistentes al ATB y Lac+ (el gen LacZα está intacto).

Mecanismo de Identificación:

• La β-galactosidasa (codificada por el gen LacZ, inducida por IPTG) actúa sobre el sustrato cromogénico X-gal.
• Solo crecen las bacterias transformadas.
• Las colonias con vector recombinante son Lac- y se observan blancas.
• Las colonias con vector no recombinante son Lac+ y se observan azules.

3. Estrategia de Proteínas Fluorescentes

• Vectores: Contienen un gen de resistencia (para selección) y un gen de proteína fluorescente (ej., GFP de medusa) para identificación.
• El polylinker está incluido en el gen de la proteína fluorescente. La inserción del ADN extraño en el polylinker inactiva el gen de la proteína fluorescente.
• Células transformadas no recombinantes: Presentan fluorescencia verde.
• Células transformadas con plásmidos recombinantes: No presentan fluorescencia.

4. Estrategia de Gen Letal

• Vectores: Contienen un gen de resistencia a ATB (para selección) y un gen de proteína letal (para identificación).
• En vectores recombinantes, la proteína letal no es funcional porque su secuencia es interrumpida por el inserto.
• Solo se desarrollan las bacterias que portan el vector recombinante.
• Bacterias no transformadas: No crecen (sensibles a ATB).
• Bacterias transformadas con vector no recombinante: Mueren por la expresión de la proteína letal.

Tasa de Transformación y Eficiencia

La Tasa de Transformación (TT) mide la eficiencia de introducción del vector en la célula huésped.

Fórmula de la Tasa de Transformación (TT):

TT = (UFC · VT) / (C · Vs)

• UFC: Unidades Formadoras de Colonias (número de colonias que crecen en la placa).
• VT: Volumen total de la solución (en µL).
• C: Cantidad de vector (recombinante y no recombinante) en µg.
• Vs: Volumen de la suspensión bacteriana transformada (en µL).

La Tasa de Transformación se expresa comúnmente como el número de células transformadas por µg de vector.

Cálculos Específicos para Estrategias Cromogénicas:

• Tasa de Transformación recombinante: Sustituir UFC por el número de colonias blancas.
• Porcentaje de células transformadas recombinantes:

  [Colonias blancas / (Colonias blancas + Colonias azules)] x 100

Cálculo con Placa Control (sin ATB):

• Para calcular el porcentaje de células transformadas respecto al total:

  [Número de colonias en placa con ATB / Número de colonias en placa sin ATB] x 100

Bibliotecas de ADN: Tipos y Aplicaciones

Las Bibliotecas de ADN son colecciones de vectores recombinantes clonados, cuyas secuencias de ADN se han obtenido de un organismo.

Tipos de Bibliotecas de ADN:

• Genómicas: Contienen vectores clonados que incluyen el genoma completo de un organismo.
• Cromosómicas: ADN construido a partir de un único cromosoma o una fracción cromosómica en metafase.
• ADNc (cDNA): Construidas a partir de ARNm de un tejido mediante transcripción inversa. Representan un subconjunto de genes que se expresan en un tipo celular y estado concreto.

Análisis de Bibliotecas de ADN:

1. Identificación de Clones: Mediante hibridación (con sondas de ADN) o inmunoensayo (para proteínas expresadas).
2. Paseo Cromosómico:
   • Permite localizar en una biblioteca clones que portan secuencias adyacentes a la de un clon conocido, mediante el solapamiento de secuencias.
   • Ejemplo: Identificar clon A (inserto B = zona solapada con otro fragmento).
3. Secuenciación: Descifrar la secuencia de ADN que porta el vector.

Aplicaciones de la Clonación Molecular y las Bibliotecas de ADN

Las técnicas de clonación molecular y el uso de bibliotecas de ADN tienen diversas aplicaciones:

• Investigación Básica: Obtención de secuencias completas de un organismo, estudio de la función génica, etc.
• Aplicaciones Industriales:
  • Médico/Farmacéutico: Producción de proteínas recombinantes (insulina, hormonas), desarrollo de vacunas.
  • Industria Química o Medioambiental: Producción de enzimas, biorremediación.
  • Desarrollo de Organismos Transgénicos (plantas, animales).
• Medicina:
  • Creación de ratones transgénicos como modelos de enfermedad.
  • Terapia Génica: Corrección de defectos genéticos.