1.Introducción

Las técnicas espectrométricas se basan en la interacción de las radiaciones electromagnéticas con la materia. Las principales los laboratorios de Bioquímica Clínica son

• Espectrometría de absorción molecular en el ultravioleta y en visible
• Fluriometría
• Turbidimetría
• Nefelometría
• Luminometría
• Espectrometría de absorción /emisión atómica.

Naturaleza de la radiación electromagnética(forma de energía radiante); se representa como un campo eléctrico y otro magnético, situados en fase y con oscilaciones sinusoidales en ángulo recto un campo respecto al otro y, a su vez, con la dirección de propagación; se propaga por lo tanto en forma de ondas.

Características de una onda electromagnética(E: campo eléctrico; H: campo magnético):

• Longitud de onda (alfa): distancia entre 2 máximos de un ciclo completo del movimiento ondulatorio; se expresa en nanómetros (nm, 10^-9m)
• Frecuencia (v): número de oscilaciones (ciclo) que una partícula realiza en una unidad de tiempo, generalmente un segundo; es la inversa de la longitud de onda.

V= c/ (longitud de onda) siendo   c= velocidad de la luz

La luz está formada por fotones, o paquetes discontinuos energía; la energía de un fotón depende de su frecuencia y de su longitud de onda:

E= h*v    siendo   v=frecuencia   y    h= Constante de Plank

E= H* c/ (alfa)

Por lo tanto la relación entre la longitud de onda y la energía de una radiación electromagnética es inversa: cuánto mayor es la longitud de onda, menor es la energía.

La relación de la longitud de onda con la frecuencia y con la energía de radiación es inversa, por lo que las radiaciones más energéticas, las más penetrantes, son a su vez las de mayor frecuencia y menor longitud de onda.

Espectro electromagnético: conjunto de radiaciones electromagnéticas, y se ha dividido en varias regiones o bandas espectrales caracterizadas por determinados parámetros de longitud de onda, frecuencia, etc

El ojo humano responde a la radiación electromagnética entre los 380 y los 750nm.

La luz solar al ojo humano se reconoce como “blanca”, es decir, es una radiación policromática

En la región visible, la luz se descompone en colores y sus complementarios.

Descomposición del espectro visible y ultravioleta en colores complementarios

El color que presentan los distintos objetos o soluciones se debe a la interacción de la radiación policromática (luz blanca) con ellos. Un objeto o solución está formado por partículas que absorben radiaciones de determinada longitud de onda y no absorben otras, que son las que pueden verse, denominándose color complementario.

Una solución que se observa de un color determinado al ojo humano, deberá ser iluminada para las mediciones fotométricas con un haz de luz del color que se absorbe.

fenómenos de interacción entre luz y materia:cuándo se produce una interacción entre un haz de luz y la materia, se producen, fenómenos de absorción o emisión energética.

• 1. Proceso de absorción:

Cuando una partícula que se encuentra en “estado de reposo” o “estado fundamental”, interacciona con un haz de luz, absorbe energía, y pasa lo que se denomina “estado excitado”.

En la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia partícula y de la energía de la luz que interacciona.

La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado fundamental, desprendiendo la energía absorbida en forma de calor.

Cada especie absorbente (cromógeno) tiene un “espectro de absorción característico”. Este espectro representa la relación entre longitud de onda incidente y la absorbancia que representa una solución de la especie, en condiciones definidas de trabajo.

Los espectros de absorción son de utilidad para:

   -seleccionar la longitud de onda (alfa) más adecuada para una medida cuantitativa (longitud de onda a la que la absorción es máxima)

   - fines de identificación cualitativa.

La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución de una especie absorbente, es el fundamento en qué se basan las técnicas de espectrofotometría de absorción.

• 2.Proceso de emisión: algunos compuestos tienen la propiedad, tras ser excitados, de retornar a su estado fundamental, produciendo una emisión de energía radiante.

La luz emitida se puede medir, y ello constituye el principio de algunas técnicas como la fotometría de llama (emisión atómica) o la Fluorescencia

2.Espectrofotometría DE Absorción MOLECULAR:

Consiste en la medición de la radiación que llega a un detector tras producirse un fenómeno de absorción de luz por parte de una sustancia absorbente.

En Química Clínica, el material en estudio es generalmente una solución, y las medidas dentro del espectro son entre los 220 y 800nm.

Es aplicable tanto para análisis cualitativos como cuantitativos.

leyes de absorción

Cuando un haz de luz de intensidad I₀ incide sobre una cubeta cuadrada que contiene una solución coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se produce en la solución un proceso de absorción, y el haz de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene una intensidad menor, I_S

Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta y considerar así sólo la solución del compuesto de interés, hay que hacer una primera medida con una “solución de referencia” o “blanco”, que contiene todos los posibles compuestos que participan en la lectura, menos el compuesto a medir. Todas las medidas que se haga continuación serán referidas a esta medida inicial.

• Transmitancia: relación entre la luz incidente y la luz transmitida.

T=I_s/I₀

En la práctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de absorbancia (A), ya que la relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica, mientras que la relación entre la absorbancia y concentración es directamente proporcional.

Al aumentar la concentración del compuesto absorbente en solución, más luz es absorbida y menos transmitida.

La absorbancia no es en sí misma medible, sino que se obtiene por un cálculo matemático a partir de los datos de transmitancia que mide el sistema fotométrico.

La relación entre las cantidades de absorbente de una solución y el grado en que esta solución absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorción.

ley de Beerindica que la concentración de la sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida o inversamente proporcional al logaritmo de la luz transmitida

La fórmula matemática establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y otras 2 variables: la concentración de la absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre a través de la solución. Según está ley, la absorbancia de una solución es directamente proporcional a la concentración de longitud de la luz:

A= a(coeficiente de absorción) *b(longitud de paso)*c(concentración)

Cálculo DE CONCENTRACIONES: la ley de Beer tiene una aplicación práctica para averiguar la concentración de una sustancia de interés en una solución basándose en la relación lineal entre absorbancia y concentración; así podemos conocer la concentración de una sustancia de dos maneras:

1. Por comparación con una solución conocida: si tenemos 2 soluciones, P (problema) y S (estándar de concentración conocida):

A_s/A_p= C_S/C_p        =>         C_p= C_S* A_p/A_S

2. Curva de calibración: representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a concentración (abscisas).

El método de trabajo consiste en ensayar varias soluciones de concentraciones conocidas, determinar sus absorbancias de continuación construir la curva de calibración (que debe ser recta), representando las concentraciones frente absorbancias gráficamente.

En toda determinación fotométrica se debe conocer la linealidad, que es el intervalo de concentración del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre la concentración y la absorbancia, es decir, se cumple la ley de Beer. Cuando la concentración del cromógeno en la solución sobrepasa los límites de la linealidad, la Ley de Beer deja de cumplirse, convirtiéndose la recta de la gráfica en una curva a partir de ese punto de concentración; la lectura de una absorbancia fuera de los límites de linealidad, se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno; ante esta situación, hay que diluir la muestra para que su concentración entre dentro de los límites de linealidad.

desviaciones de la Ley de Beer: desviaciones producidas en la linealidad de la relación entre concentración y absorbancia;  la recta se curva antes de su límite de linealidad. Pueden causarlas diversos factores:

• Se miden concentraciones muy elevadas de cromógeno
• La radiación incidente no es monocromática
• La absorbancia del solvente es significativa comparada con la del soluto
• La luz es transmitida por otros mecanismos
• Los lados de la cubeta no son paralelos
• Si hay interferencias s
• Si existe fenómenos de fluorescencia

componentes de un espectrofotómetro

1. Fuente de radiación
2. Rendijas de entrada y de salida
3. Sistema selector de la longitud de onda
4. Detector de la energía radiante.
5. Sistema de recogida y transformación de datos.

1. FUENTE DE Radiación: origen de la emisión energética en forma de radiación electromagnética, y proporciona la energía radiante que es absorbida por el compuesto que se investiga. Sus características ideales son: que la radiación emitida sea de gran potencia, que sea estable y que emita radiaciones de longitudes de onda de un intervalo del espectro amplio y sin discontinuidades.

Pueden clasificarse en:

-Fuentes continúas (lámparas):

• Lámparas de filamento de tungsteno: espectro visible y UV próximo.
• Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duración, emiten energía radiante de mayor intensidad que las de filamentos de tungsteno; región visible y UV próximo
• Lámparas hidrógeno y deuterio: producen un espectro continuo en la región UV
• Lámparas de arco de xenón: longitudes de onda entre 200 y 10.000nm.

-Fuentes discontinuas: sólo emiten radiaciones de determinadas longitudes de onda aislada, se pueden considerar monocromáticas;  son útiles para la calibración de la longitud de onda pero resultan poco prácticas para hacer medidas de absorbancia.

2. RENDIJAS:

1. De entrada: su función es reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz dispersa penetre en el sistema de selección de la longitud de onda.
2. De salida: su función es impedir que la luz difusa atraviese la cubeta, lo que generaría desviaciones a la Ley de Beer.

3. SISTEMAS DE Selección DE LONGITUD DE ONDA: su finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitudes de onda deseados para el análisis.

1. Filtros: mecanismo sencillo compuesto por un material que transmite selectivamente una longitud de onda y absorbe todas las demás; permiten el paso de intervalos, relativamente amplios y característicos, de longitudes de onda.

-Filtros de absorción: según el tipo de intervalo de onda que seleccionan se pueden distinguir:

• Filtros de corte: impiden el paso de radiaciones de longitud de onda superior o inferior a un determinado valor.
• Filtros de banda: permiten el paso de radiaciones de longitud de onda entre dos valores determinados.

-Filtros de interferencia: la radiación que incide sobre el filtro sufre una serie de reflexiones y se producen interferencias tanto positivas como negativas, de modo que sólo consiguen atravesar el filtro aquellas radiaciones que tienen unas determinadas longitudes de onda.

1. Monocromadores: son capaces de dar bandas espectrales mucho más estrechas que los filtros y, tienen la ventaja adicional de poderse ajustar fácilmente dentro de una amplia zona del espectro.

Sistema dispersor puede ser:

• Prismas: fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico o cualquier otro material que permita la transmisión de la luz.

La dispersión de la radiación de los atraviesa se debe a la refracción y ofrecen una buena separación entre las longitudes de onda dispersadas; sin embargo, tienen el inconveniente de que desvían más las radiaciones de longitud de onda más corta y por tanto la dispersión no es lineal.

Si se trabaja en una zona del visible y en la del UV próximo, se puede utilizar prismas de vidrio pero si se trabaja en el UV lejano, hande ser de cuarzo.

• Redes de difracción: consisten en un gran número de líneas (hendiduras) paralelas, situadas a distancias iguales entre sí, trazadas sobre un vidrio o superficie metálica. Cuando incide la luz blanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeño prisma; se producen interferencias positivas y negativas de las diferentes longitudes de onda contenidas en la radiación policromática y el resultado es que sólo se propagan las radiaciones de determinadas longitudes de onda.

4. COMPARTIMENTO PARA LA MUESTRA: el receptáculo en el que se deposita la muestra se denomina cubeta; su función es mantener la solución en el instrumento mientras se realiza la medición de absorción

• Forma: pueden ser

  -Cilíndricas

  -Cuadradas

  -Rectangulares: la más empleada

• Tamaño: habitualmente tienen 1 cm de paso de luz

   -Rectangulares: normal, sencillo o micro

• Material: puede ser

   -Vidrio: la mayoría, para longitud de onda de 320-950nm

   -Plástico: para longitud de onda de 320-950nm

   -Cuarzo: para longitud de onda inferiores a 320 nm, porque el vidrio absorbe la luz UV; también se podrían emplear para longitudes de onda superiores pero su costo lo desaconseja

En algunos casos existen dispositivos termostatizadores que mantienen las cubetas a la temperatura adecuada para la medición; importante cuando se determina actividades enzimáticas o se emplea enzimas para realizar las mediciones.

Hay cubetas de flujo continuo que poseen un orificio de entrada y otro de salida que permita el paso continuado de la disolución mientras se realiza la medida.

Es importante que las cubetas se mantengan limpias y sin arañazos para evitar errores en la medida.

5. SISTEMA DE Detección DE RADIACIONES: sistemas que amplifican y transforman la energía radiante no absorbida por la muestra en energía eléctrica y la convierten en una señal eléctrica y cuantificable. Pueden ser: dispositivos fotoemisores y diodos.

6. SISTEMAS DE Presentación DE DATOS: la energía eléctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentación de datos.

Tipos de aparatos:

• Según el sistema selector de longitud de onda:

   -Fotómetros: emplean filtros

   -Espectrofotómetros: emplean monocromadores

Aspectos prácticos

• Empleo de blancos: antes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un “blanco”: esta maniobra eliminará las posibles interferencias de absorción o reflexión por parte de la propia cubeta o el solvente del cromógeno

Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, sólo con el solvente; se establecerá una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solución, que marcará las condiciones iniciales de trabajo.

La absorbancia del blanco se restará de las absorbancias que se midan para los problemas.

   -Blanco de suero: la lectura inicial se hace con el suero diluido en la misma proporción en un solvente inerte, con el que no reaccione. Elimina las posibles interferencias que pueda producir la propia muestra.

   -Blanco del reactivo: la lectura inicial se hace sobre el reactivo, antes de adicionarle la muestra. Elimina las posibles interferencias que pueda producir el reactivo.

   -Blanco muestra: cuando el espécimen biológico que se analiza puede interferir la señal que se detecta

   -Blanco agua destilada

   -Blanco aire

• Curvas de calibración: se construyen ensayando soluciones de distintas concentraciones conocidas y estableciendo para cada una de ellas su absorbancia a una determinada longitud de onda.
• Empleo de factores de calibración:

C problema= A problema* C estándar/ A estándar

C estándar/ A estándar es constante, es el factor de calibración

Tipos de análisis espectrofotométricos:

• Según el desarrollo de la reacción:

   -A punto final

   -Cinéticos

• Según algunas características de la reacción

   -Colorimétricos