Pureza de ácidos nucleicos: cocientes A260/A280 y A260/A230 y valores óptimos

Determinación de la Pureza de los Ácidos Nucleicos

La pureza de un ácido nucleico es un parámetro crucial que determina la ausencia de contaminantes. El grado de pureza se mide basándose en una propiedad fundamental de los ácidos nucleicos: su máxima absorbancia a una longitud de onda de 260 nm.

Cociente A260/A280

El cociente A260/A280 es el parámetro más utilizado para evaluar la pureza. Los principales contaminantes de los ácidos nucleicos (proteínas y compuestos fenólicos) presentan un máximo de absorbancia a 280 nm. Por lo tanto, la relación entre las absorbancias a 260 nm y 280 nm proporciona una indicación del grado de contaminación de la muestra.

Para evitar errores, la absorbancia medida debe estar dentro del rango lineal del espectrofotómetro, idealmente entre 0,1 y 1. Las mediciones se realizan típicamente en muestras diluidas en agua destilada o tampón TE. Antes de medir, se ajusta el espectrofotómetro a cero de absorbancia utilizando el mismo diluyente.

Valores del Cociente A260/A280 en el ADN y Acciones Correctivas

• Pureza adecuada: Un cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0 indica una pureza adecuada para el ADN.
• Valores inferiores a 1,6: Sugieren contaminación excesiva por proteínas o fenoles.
  • Contaminación por proteínas: Se puede tratar con proteinasa K.
  • Contaminación por fenoles: Requiere repetir la purificación con cloroformo/alcohol isoamílico y precipitar el ADN con isopropanol o etanol.
• Valores superiores a 2,0: Indican una concentración elevada de ARN, ya que el ARN absorbe más a 260 nm que el ADN. La contaminación por ARN se puede eliminar mediante tratamiento con ARNasas.

Valores del Cociente A260/A280 en el ARN

Se considera que el ARN tiene un grado de pureza adecuado cuando el cociente A260/A280 se encuentra entre 1,8 y 2,1.

Cociente A260/A230

El cociente A260/A230 es un parámetro adicional para evaluar la calidad de los ácidos nucleicos. A 230 nm, se detecta la máxima absorbancia de contaminantes menores, como carbohidratos y sales.

• Pureza adecuada: un valor entre 1.5 y 2.2.
• Valor inferior a 1.5: indica presencia de contaminantes. Se recomienda precipitar y lavar de nuevo el ácido nucleico con etanol, dejarlo secar y resuspenderlo.

Este cociente no es tan específico como el A260/A280 para medir la pureza, especialmente cuando la concentración de ácido nucleico es baja y se utiliza un tampón de resuspensión con sales.