Espectrometría de Masas: Fundamentos, Instrumentación y Aplicaciones en Biomoléculas

Espectrometría de masas: técnica que permite la separación y determinación de la relación masa/carga (m/z) de iones gaseosos

La espectrometría de masas (medición de rango) se diferencia de la espectroscopía (absorción o emisión de energía radiante).

Espectrometría de masas de biomoléculas

Permite determinar la masa y la composición de: péptidos, proteínas, complejos supramoleculares, polisacáridos, oligosacáridos y lípidos.

Espectrometría de masas de proteínas

Se utiliza para la identificación por comparación con bases de datos, la secuenciación de péptidos, el plegamiento y las modificaciones postraduccionales.

Iones: su importancia

El proceso de ionización genera distintos tipos de iones:

• [M+H]+ o [M-H]-: por protonación o desprotonación de aminas, carboxilos, fenoles o fosfatos.
• [M+2H]2+, [M+nH]n+.
• [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+Cl]-: por la unión de iones, especialmente en moléculas que contienen oxígeno (Na = 23; K = 39).
• [M]*+ y [M]*-: por oxidación o reducción monoelectrónica (no muy común).

Espectrometría de masas: esquema general

Muestra → Entrada → Volatilización/ionización → Analizador de masas → Detector → Alto vacío.

Técnicas de ionización y analizadores

Técnicas: MALDI, ESI, TOF, Cuadrupolo, Trampa de iones, FTICR, Sector magnético.

Ionización por MALDI

La biomolécula se mezcla con una matriz que absorbe la energía de un láser. Al disiparla, se produce la coevaporación de la muestra: la energía agregada hace que la matriz explote, llevando la proteína cargada hacia la entrada del analizador. Este proceso de desorción está asociado a la transferencia de H+. Las proteínas cargadas son dirigidas al analizador mediante un campo eléctrico.

MALDI-TOF

Determina la masa de la molécula cargada de acuerdo a su tiempo de vuelo (t), donde t α (m/z)^1/2. Las partículas con menor m/z llegan antes al detector. No tiene buena resolución, pero es robusto y tiene un rango de masa virtualmente ilimitado (hasta 300 kDa). Los iones positivos generados en la fuente MALDI son acelerados por un campo eléctrico E que imparte una energía cinética Ek = zeEs, donde S es la distancia de la región de la fuente.

ESI-MS (electrospray ionization-quadrupole)

La proteína se introduce en el analizador a través de un capilar sometido a un fuerte voltaje, rodeado por un flujo de N2. El fuerte voltaje hace que se formen gotas muy pequeñas y cargadas (spray). El analizador es un filtro de masa cuadrupolar, llamado así porque transmite iones de un pequeño rango de m/z; los demás iones son neutralizados y eliminados. Consiste en cuatro barras cilíndricas metálicas que sirven como electrodos del filtro. Es robusto, barato y de tiempo de barrido breve, pero no tiene buena resolución y su rango de m/z llega hasta 3000.

Comparación MALDI-TOF / ESI-Q / ESI-Q3 / IT

Fundamento de la técnica

La espectrometría de masas es una técnica de análisis cuantitativo de amplia utilización para determinar la estructura de compuestos orgánicos, sola o en combinación con otras técnicas espectrofotométricas. No utiliza ningún tipo de radiación, por lo que no se considera una técnica espectroscópica.

La técnica se basa en la obtención de iones a partir de moléculas orgánicas en fase gaseosa. Una vez obtenido el ion, se separa de acuerdo a su masa y su carga, y finalmente se detecta mediante un dispositivo. El espectro de masas es una representación bidimensional que relaciona la abundancia de los distintos tipos de iones en función de la relación masa/carga (m/z) de cada uno.

Instrumentación

El espectrómetro debe cumplir cuatro funciones:

1. Vaporizar sustancias de volatilidades muy diferentes.
2. Una vez volatilizada la muestra, originar iones a partir de moléculas neutras en fase gaseosa.
3. Una vez generados los iones, separarlos en función de su relación masa/carga.
4. Una vez separados los iones, detectarlos y registrar la información adecuadamente.

Componentes (4 partes independientes)

1. Sistema de introducción de muestra: el principal factor limitante es la posibilidad de vaporizar la muestra. La condición necesaria para obtener el espectro es que su presión de vapor sea igual o superior a 10^-6 mm de Hg a una temperatura que no pirolice. No siempre es necesario vaporizar la muestra.

2. Métodos de introducción de muestra:

• Introducción indirecta: la vaporización se realiza en un recipiente externo al espectrómetro, mantenido a temperatura elevada.
• Introducción directa: la muestra se introduce directamente en la fuente de iones mediante una varilla metálica que lleva en la punta un capilar que contiene la muestra.
• Introducción a partir de cromatógrafo: sistema popularizado en el análisis por espectrometría; se realiza directamente en fase gaseosa y el cromatógrafo realiza la separación de los diversos componentes de la mezcla.

3. Fuente de iones:

• Ionización por impacto electrónico: las moléculas de la muestra son ionizadas mediante un haz de electrones de elevada energía. Los electrones se generan por un filamento incandescente que emite por efecto termoeléctrico y son acelerados mediante una diferencia de potencial variable. Problema: algunos iones son más estables que otros, y en algunos casos el ion molecular no se descompone.
• Ionización química: se utiliza un agente ionizante, un ion que transfiere su carga a la molécula de la muestra mediante una reacción ion-molécula. Se introduce metano en la fuente de iones a 1 mm Hg de presión.
• Ionización en superficie: la muestra se vaporiza e ioniza sobre una superficie a elevada temperatura.
• FAB (fast atom bombardment): la muestra es ionizada por bombardeo con iones de elementos ligeros.
• LAMMA: vaporización e ionización producidas mediante una fuente láser.

4. Analizador de masas: los más usados son los de campo magnético y los cuadrupolares, muy utilizados en equipos combinados con cromatógrafo de gases, y los analizadores de trampa de iones. Están provistos de una rendija de salida con el fin de aislar los iones cuya trayectoria tenga el radio de deflexión necesario para dirigirse hacia el detector.

Analizador para separación de iones (trampa de iones)

Se utiliza como detector cromatográfico más que en sistemas reales de acoplamiento. Es una modificación del analizador cuadrupolar, basado en una zona de confinamiento electromagnético generada mediante dos señales de radiofrecuencia. Está formado por tres electrodos de superficie hiperbólica: el electrodo central, de forma anular, y los electrodos superior e inferior, que cierran los extremos del anillo y forman una cavidad donde se produce la ionización, la fragmentación y el análisis de masas. Presenta la ventaja de una sensibilidad bastante elevada y una velocidad de barrido alta.

Sistema detector y registrador

Analizador de tiempo de vuelo (TOF): los iones generados en la fuente son acelerados mediante un pulso de potencial eléctrico, lo que proporciona a todos los iones del paquete una misma energía. La velocidad adquirida por cada ion es inversamente proporcional a su relación m/e.

Problema principal: el tiempo que tarda el ion en alcanzar el detector en un analizador típico se encuentra en el entorno de unos pocos microsegundos, lo que exige sistemas de detección extremadamente rápidos.

Funcionamiento típico: la muestra se vaporiza y se somete durante aproximadamente 1 µs a un pulso de electrones que da lugar a la ionización. Luego se aplica un potencial de aceleración durante un tiempo menor al utilizado para la generación de iones, de forma que todos los iones de la muestra son acelerados de forma casi simultánea.

Tipos de detector (3)

• Caja de Faraday: contiene una placa ligeramente inclinada para evitar la reflexión de iones. Al chocar con la placa, los iones toman electrones de ella para neutralizar su carga; la corriente electrónica necesaria para neutralizar los iones se mide y se utiliza para determinaciones cuantitativas, en particular la determinación de la abundancia isotópica.
• Multiplicador de electrones.
• Detección fotográfica: se usa en muy pocos equipos y únicamente cuando se requiere una sensibilidad altísima.

Sistema de vacío

Los principales tipos de bomba para conseguir el nivel de vacío en un espectrómetro de masas son la bomba difusora y la bomba turbomolecular.

Bomba difusora de aceite: funciona mediante refrigeración, calefacción, ebullición de aceite y una bomba rotatoria. Ofrece la ventaja de tener gran duración, un mantenimiento muy sencillo y no ser propensa a averías.

Bomba turbomolecular: consiste en una turbina con una serie de álabes que se mueven a velocidad supersónica, en proximidad de una serie de álabes fijos. Ofrece la ventaja principal de alcanzar rápidamente su régimen de funcionamiento, junto con un riesgo nulo de contaminación de la cámara de vacío del espectrómetro.

Contrapartida: el costo de mantenimiento y reparación suele ser elevado. El caudal que debe proporcionar el sistema de bombeo para asegurar el nivel de vacío necesario en el interior del espectrómetro depende lógicamente del tamaño de la zona de vacío.

Compuestos aromáticos

Compuestos aromáticos básicos:

• CHO = benzaldehído
• OH = fenol
• NO₂ = nitrobenceno
• COOH = ácido benzoico
• O-CH₃ = anisol
• SO₃H = ácido bencensulfónico
• CH₃ = metilbenceno o tolueno

Disustituyentes

Nombre común: orto, meta, para.

Nombre IUPAC: 1,2- / 1,3- / 1,4-.

Reacciones de sustitución electrofílica aromática

Halogenación (trabaja con cloro y bromo):

• Con bromo: compuesto + Br₂ (catalizador FeBr₃) → compuesto bromado + HBr + FeBr₃
• Con cloro: compuesto + Cl₂ (catalizador AlCl₃) → compuesto clorado + HCl + AlCl₃

Alquilación: compuesto + CH₂-CH₃ + Cl (catalizador AlCl₃) → compuesto con etilo + HCl + AlCl₃

Acilación (trabaja siempre con cloro). Ejemplo: para obtener fenil propil cetona, compuesto + C-C-C-CO + Cl (catalizador AlCl₃) → compuesto con propilo y cetona + HCl + AlCl₃

Nitración: se obtiene nitrobenceno (NO₂): compuesto + HNO₃ (catalizador H₂SO₄) → compuesto nitrado + H₂SO₄ + H₂O

Sulfonación: compuesto + H₂SO₄ (catalizador H₂SO₄) → compuesto sulfonado + HSO₃ + H₂O + H₂SO₄

Orientación de los sustituyentes

Solo en orto y para: fenol (OH), anilina (NH₂).

Meta: nitrobenceno (NO₂), ácido bencensulfónico (SO₃H), nitrilo (CN).

Nomenclatura

• Nombres comunes: (OH) fenol, (NH₂) anilina, (COOH) ácido benzoico.
• Nombres sistemáticos: (OH) hidroxibenceno, (NH₂) aminobenceno, (COOH) carboxibenceno.