Identificación bacteriana: pruebas bioquímicas y técnicas de laboratorio

Identificación bacteriana: pruebas bioquímicas

• Observación microscópica
• Morfología (cocos, bacilos, estreptococos, etc.)
• Gram: Gram positivos, Gram negativos, no se tiñen con Gram.
• Tinciones estructurales (cápsula, flagelos, esporas, etc.)
• Técnicas inmunológicas (IgG, IgM).
• Técnicas moleculares (PCR – reacción en cadena de la polimerasa), ADN.
• Técnicas bioquímicas.

1.- Detección de hemolisinas en agar sangre

El agar sangre permite comprobar si la bacteria es productora de hemolisina (proteínas capaces de lisar los eritrocitos presentes en el medio de cultivo). Si la hemólisis producida por la bacteria es total se denomina β-hemólisis, y se pone de manifiesto por la aparición de una zona de hemólisis (transparencia) alrededor del crecimiento bacteriano. Si la hemólisis es parcial se denomina α-hemólisis, que aparece como un cerco de color verdoso alrededor del crecimiento bacteriano, y cuando no existe se denomina γ-hemólisis. Los estreptococos patógenos son β-hemolíticos.

2.- Fermentación de la lactosa en Mac Conkey

Mac Conkey es un medio selectivo, por contener sales biliares y cristal violeta que inhiben el crecimiento de las bacterias que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae (no siempre). Es también un medio diferencial, porque contiene lactosa y un indicador de pH. Las bacterias capaces de fermentar este azúcar producen un cambio en el pH del medio por liberación de ácido láctico; como consecuencia, las colonias aparecerán de color fucsia, violeta, rosa, contrastando con la coloración amarilla de las colonias de las bacterias incapaces de utilizar la lactosa.

• Lactosa positivas: Shigella, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter.
• Lactosa negativas: Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia y Serratia.

4.- Prueba de la catalasa

En los ambientes acuosos que contienen oxígeno disuelto, dentro del citoplasma de las células pueden aparecer formas tóxicas derivadas del oxígeno, de forma que estas bacterias necesitan un equipo enzimático capaz de neutralizar las formas tóxicas. Entre estas enzimas se encuentra la catalasa, que convierte el peróxido de hidrógeno (agua oxigenada) en agua y oxígeno.

catalasa
2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂ (burbujas)

La prueba de la catalasa es positiva cuando se enfrenta la bacteria a peróxido de hidrógeno al 3% y se producen burbujas de oxígeno. Esta prueba es muy útil para diferenciar el género Staphylococcus (catalasa +) de Streptococcus (catalasa −).

5.- Prueba del citrato de Simmons

Este medio indica la capacidad de las bacterias para utilizar el citrato, ya que contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato amónico como única fuente de fósforo y azul de bromotimol como indicador de pH. Solo las bacterias capaces de metabolizar el citrato podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, utilizan los fosfatos presentes liberando iones amonio. Esta liberación de iones básicos, junto con la eliminación del citrato (ácido), genera una fuerte basificación del medio que se pondrá de manifiesto por un cambio de color del indicador, pasando de verde a azul.

7.- Agar de Kligler

Este medio, de color rojo, es muy útil ya que demuestra varias características enzimáticas de la bacteria. Está compuesto principalmente por dos azúcares (glucosa 0,1% y lactosa 1%), además de tiosulfato sódico, citrato férrico y rojo fenol como indicador de pH. Para estudiar el comportamiento de las bacterias en aerobiosis y anaerobiosis, la siembra se realiza de la siguiente forma:

Tras la incubación (18-24 h a 37 ºC), la información que podemos obtener es la siguiente:

Fermentación de la glucosa: Se da fermentación de la glucosa si se produce viraje a color amarillo en el fondo del slant. Si la bacteria metaboliza solo la glucosa, en la superficie del slant la utilizará por vía respiratoria, mientras que en profundidad la utilizará por vía fermentativa. Esta genera una pequeña cantidad de ácido que en superficie será neutralizada por las aminas derivadas de la descarboxilación oxidativa de las proteínas (proceso que se da solo en aerobiosis). Como resultado, el medio mantendrá su color rojo en la superficie al no haber cambio de pH. Por el contrario, las bacterias que crecen en profundidad utilizan la glucosa por vía fermentativa generando ácido que no será neutralizado, produciendo un descenso del pH que cambia el color del fondo del tubo (amarillo).

Fermentación de la lactosa: La bacteria utiliza la lactosa si se da viraje o cambio a color amarillo en la superficie del slant. Si la bacteria además fermenta la lactosa, los ácidos producidos modificarán también el pH de la superficie del medio, pero en este caso las aminas presentes en la superficie no son capaces de neutralizar la cantidad de ácido producido (ya que la lactosa se encuentra en el medio a mayor proporción que la glucosa), como consecuencia el color del medio cambiará a amarillo.

No fermentación de azúcares: En este caso el slant no cambia de color (se mantiene rojo). Si la bacteria es aerobia estricta (no fermentadora), como Pseudomonas, el medio permanecerá de color rojo, pues los azúcares se utilizan por vía respiratoria y no modifican el pH del medio.

Producción de gas: Se pone de manifiesto por la aparición de burbujas, roturas o elevación del slant.

Producción de sulfhídrico: Se pone de manifiesto por la aparición de un precipitado de color negro en el fondo del tubo. Esto se debe a que algunas bacterias utilizan el tiosulfato sódico como aceptor final en la cadena transportadora de electrones. Como consecuencia, este compuesto se reduce a ácido sulfhídrico que reacciona con el hierro presente en el medio formando un precipitado negro de sulfuro de hierro.

9.- Prueba del indol

Esta prueba se emplea para detectar la presencia de triptofanasa en bacterias. Esta enzima degrada el triptófano (aminoácido) a indol, que es el compuesto que se detecta en el ensayo. Para la realización de la prueba, la bacteria se cultiva en agua de peptona o triptona. Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al añadir al medio el denominado reactivo de Kovacs se producirá un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba será positiva. El reactivo de Kovacs contiene p-dimetilaminobenzaldehído, que puede reaccionar tanto con el indol como con el triptófano produciendo compuestos de coloración rojiza. Para evitar la interferencia del triptófano, este se disuelve en alcohol isoamílico, que es inmiscible en agua. A diferencia del triptófano, el indol es soluble en el alcohol y, por tanto, solo reaccionará con el p-dimetilaminobenzaldehído. Esta prueba es muy utilizada para diferenciar E. coli.

10.- Prueba del rojo de metilo y Voges-Proskauer

Se utiliza para la identificación de enterobacterias, que son anaerobias facultativas y utilizan la glucosa en dos fases:

1ª: La metabolizan por vía aerobia consumiendo el O₂ del medio.

2ª: Continúan metabolizándola por vía anaerobia o vía fermentativa.

Esta fermentación puede ser de dos tipos dependiendo de los productos obtenidos:

• Fermentación ácido-mixta: los productos finales son ácidos orgánicos (fórmico, láctico, succínico), y además se produce etanol.
• Fermentación butilenglicólica: si los productos finales son compuestos neutros como butanodiol y etanol, produciendo acetona como intermediario.

La liberación de ácidos orgánicos genera un acusado descenso del pH, que puede ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de metilo.

Si la fermentación es de tipo butilenglicólica, la producción de acetoína puede ser detectada añadiendo al medio hidróxido potásico y α-naftol, que reaccionarán produciendo un color rojo característico.

12.- Prueba del amoníaco

Para esta prueba se incuba la bacteria en agua de peptona durante 5 días. Se humedece un trozo de papel de filtro con reactivo de Nessler y se deposita en la parte superior del tubo. Se calienta el tubo en baño termostático a 60 ºC; si hay amoníaco presente se pone de manifiesto por el cambio de color del papel de filtro a pardo o negro.

14.- Hidrólisis de la caseína

Se utiliza agar leche desnatada y se observa un halo de transparencia alrededor de las colonias de las bacterias que hidrolizan la caseína.

Inconvenientes: Las bacterias fermentadoras de la lactosa pueden dar falsos positivos. Para descubrir estas falsas reacciones se vierte sobre el medio una solución de cloruro mercúrico al 10% en HCl al 20%. Si desaparece el halo transparente, es que no se ha hidrolizado la caseína.

15.- Prueba de la ureasa

Se utilizan medios que contienen urea y se incuba el microorganismo a un mínimo de 4 días. Si la bacteria tiene la enzima ureasa, se desdobla la urea presente en el medio formando amoníaco, que alcaliniza el medio produciendo un viraje del indicador (rojo fenol) de amarillo o naranja a fucsia.

16.- Prueba de la coagulasa

La posesión de la enzima coagulasa, que coagula el plasma, es una propiedad casi exclusiva de Staphylococcus aureus. Existen dos formas de realizar esta prueba:

1º En portaobjetos: Se emulsionan una o dos colonias en una gota de agua sobre un portaobjetos. A continuación se mezcla con una gota de plasma humano o de conejo y se agita la suspensión bacteriana. Staphylococcus aureus aglutina en 10 segundos, formando grumos visibles; la prueba es positiva. Siempre se debe introducir un control positivo con un Staphylococcus coagulasa conocido.

2º Reacción en tubo: Se hace para confirmar la reacción en portaobjetos si la prueba en este es negativa. Se añaden 200 µl de plasma a 800 µl de caldo nutritivo en un tubo Eppendorf. Se siembra con el Staphylococcus sospechoso y se incuba a 37 ºC en baño maría durante 6 horas. Se examina a la hora y luego cada ½ hora. (Conviene comentar que el plasma citratado puede ser coagulado por microorganismos que utilizan citrato como Pseudomonas, Serratia y Enterococos, por lo que se recomienda usar plasma con EDTA, oxalato o heparina). Staphylococcus aureus puede formar un coágulo, licuar todo el contenido del tubo o producir una trama floja de fibrina. Precaución: la prolongación de la incubación puede dar lugar a la desaparición del coágulo por digestión.

18.- Producción de sulfhídrico

Para realizar esta prueba se utiliza un caldo nutritivo o agua de peptona con la bacteria sospechosa, y se coloca una tira de papel de filtro impregnado con acetato de plomo, sujetada con algodón. A continuación se incuba a 37 ºC durante una noche y a la mañana siguiente se examina el ennegrecimiento del papel (prueba positiva). Las tiras comercialmente se venden como tiras Jonsén o tiras Difco.

21.- Prueba de la fosfatasa

Para esta prueba se utiliza agar fosfato fenolftaleína y se incuba la bacteria sospechosa durante una noche. Tras el crecimiento se expone la placa a vapores de amonio durante 1 min 30 seg. Las colonias fosfatasa + virarán a color rosa. Sirve para diferenciar Staphylococcus aureus (fosfatasa +) de Clostridium perfringens.

24.- Prueba de la movilidad

Se utiliza para saber si el microorganismo sospechoso es móvil o no. Para ello se preparan tubos con un agar semisólido (agar blando, comercialmente llamado “medio movilidad”). A continuación se siembra por picadura y se incuban, preferentemente, a 31 ºC. A la mañana siguiente se observa la movilidad por el desplazamiento respecto a la línea sembrada.