Ingeniería Genética y ADN Recombinante: Fundamentos y Aplicaciones

Ingeniería Genética y ADN Recombinante

La ingeniería genética es la alteración artificial y deliberada del genoma de un ser vivo, modificando directamente su ADN. Para ello, se necesita aplicar una serie de métodos y técnicas que reciben el nombre de tecnología del ADN recombinante, un conjunto de técnicas que permiten alterar las características de un organismo mediante la modificación dirigida y controlada de su genoma, añadiendo, eliminando o modificando alguno de sus genes.

Formación Molecular de ADN Recombinante

Se denomina ADN recombinante a las moléculas de ADN que resultan de la unión de un gen elegido y un vector adecuado para su transporte. Este proceso se lleva a cabo en tres etapas:

• Corte en fragmentos de ADN: Las enzimas endonucleasas de restricción tienen la finalidad de cortar el ADN solo en determinadas secuencias de nucleótidos. Actúan como tijeras moleculares.
• Separación de fragmentos de ADN: Cuando se ha cortado una molécula de ADN con enzimas de restricción, se forman fragmentos de diferentes tamaños. Para separarlos se utiliza la electroforesis en gel, que se basa en que, al aplicar un campo eléctrico a los distintos fragmentos de ADN, estos se desplazan por el gel en función de su carga y tamaño, formando diferentes bandas.
• Unión al vector: Una vez separados los fragmentos, hay que unirlos a otras moléculas de ADN llamadas vectores. Es frecuente que sean plásmidos bacterianos, genomas víricos o ADN artificial. La unión se hace por medio de la enzima ADN ligasa, formándose entonces el ADN recombinante.

Clonación del ADN y Vectores

Clonar es hacer copias idénticas; se obtiene así un conjunto de numerosas copias del gen clonado.

• Aislamiento y obtención del gen: Se corta el ADN cromosómico en sitios concretos para obtener el gen que interesa mediante las endonucleasas de restricción.
• Selección del vector de clonación: Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, generalmente circulares, que tienen la capacidad de autorreplicarse dentro de las células hospedadoras, independientemente de los cromosomas de estas. Se utilizan con frecuencia tres tipos de vectores:

Plásmidos

Son moléculas de ADN circular presentes en la mayoría de las bacterias, de menor tamaño que el cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano porque tienen su propio origen de replicación. Además, deben portar otros genes (marcadores) que permiten identificar a las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores genes de resistencia a antibióticos; de esta forma, se pueden identificar fácilmente las bacterias que contengan el vector de clonación (con el gen clonado), ya que serán resistentes a determinados antibióticos.

• Formación de una molécula de ADN recombinante: La unión covalente del gen a clonar con el vector de clonación mediante la ADN ligasa produce el ADN recombinante.
• Introducción en la célula hospedadora: El ADN recombinante se introduce en una célula hospedadora, la cual proporciona la maquinaria necesaria para la replicación de las moléculas recombinantes. Las células hospedadoras deben cumplir una serie de requisitos para poder ser utilizadas en los procesos de clonación: experimentar un crecimiento rápido, no ser patógenas o peligrosas, y ser capaces de tomar del medio externo moléculas de ADN e importarlas al conjunto de su genoma.
• Comprobación de la expresión del gen clonado y selección de células hospedadoras: El gen que interesa se puede detectar mediante genes marcadores (generalmente de resistencia a antibióticos). Las colonias bacterianas que sean resistentes a los antibióticos marcadores habrán incorporado el vector (plásmido) y, por tanto, el gen deseado.

Producción de Plantas Transgénicas

La introducción de ADN recombinante en plantas tiene un gran interés en la agricultura, y en la actualidad se producen muchas plantas transgénicas. La producción de una planta transgénica consta de dos etapas fundamentales:

1. Transformación: Proceso de inserción del gen que se pretende introducir (transgen) en el genoma de la célula de la planta a transformar.
2. Regeneración: Obtención de una planta completa a partir de esa célula vegetal transformada.

Para introducir el nuevo gen en el genoma de la célula vegetal se utilizan dos métodos:

• Método de Agrobacterium: El más común utiliza una bacteria del suelo, Agrobacterium, que es capaz de transferir genes a las células vegetales. Muchas células vegetales pueden recibir ADN externo mediante la bacteria Agrobacterium tumefaciens portadora del plásmido Ti. Esta bacteria es un patógeno vegetal y en dicho plásmido están los genes de virulencia causantes de tumoraciones en la planta. El fragmento de ADN transferido (ADN-t) se integra en los cromosomas de la célula vegetal y se expresa. El plásmido Ti se puede manipular de tal manera que en la región ADN-t se eliminen los genes de virulencia y se sustituyan por los genes que se quiera introducir en la planta, como genes de resistencia a enfermedades o genes de mayor rendimiento en productividad.
• Método directo (Biolística): Introducción directa de los genes en el núcleo de la célula vegetal disparando a las células con microproyectiles metálicos recubiertos de ADN que penetran en la célula e integran el nuevo ADN en su genoma.

Una vez que la célula vegetal ha sido transformada, es necesario regenerar la planta entera a partir de ella mediante cultivos de tejido vegetal en medios que favorecen la regeneración. Se utilizan genes de resistencia a antibióticos para asegurar que solo sobrevivan las células modificadas.

Un caso interesante es la obtención de plantas transgénicas de tomate, soja y algodón a las que se les ha incorporado un gen que produce la resistencia al glifosato, principio activo de los herbicidas que no dañan al cultivo. También se han obtenido plantas transgénicas de tomate con genes que alargan el periodo de conservación y almacenamiento, evitando la maduración prematura del fruto.

Bacterias Transgénicas y Biorremediación

Las actuaciones biotecnológicas ambientales se centran en dos aspectos:

• Biodegradación: Descomposición mediante organismos de materiales como papel, pintura, textiles, hormigón e hidrocarburos.
• Biorremediación: Utilización de microorganismos para eliminar del medio ambiente sustancias contaminantes.

Algunas bacterias son capaces de degradar los hidrocarburos gracias a la acción de ciertas enzimas desintoxicantes. Hay estirpes de Pseudomonas modificadas genéticamente que contienen genes en un plásmido que les permiten degradar hidrocarburos, por lo que se emplean en la limpieza de tanques de petroleros y refinerías. Algunas bacterias pueden utilizar los hidrocarburos como fuente de carbono y otras producen sustancias surfactantes que, al emulsionar las manchas del vertido, facilitan su degradación.

Ingeniería Genética y Medicina

Las aplicaciones biosanitarias de la biotecnología incluyen:

Obtención de Proteínas de Mamíferos

Obtención de Insulina Humana

Para producir insulina humana a nivel industrial se recurre a microorganismos como la levadura Saccharomyces cerevisiae o Escherichia coli, en las cuales se clona el gen de la insulina humana.

La molécula de insulina consta de dos cadenas polipeptídicas (A y B) unidas mediante puentes disulfuro. Para conseguir que las bacterias produzcan insulina humana se han seguido dos caminos:

1. Producción de un precursor (proinsulina): Se sintetiza una cadena polipeptídica más larga (proinsulina) y posteriormente se elimina la parte central por métodos químicos para formar las cadenas A y B unidas por puentes disulfuro.
2. Producción de las cadenas A y B por separado y unión posterior: Puesto que las cadenas polipeptídicas de la insulina son cortas, resulta más rentable sintetizar en el laboratorio los polinucleótidos que las codifican. Se fabricó un ADN sintético para la cadena A y otro para la cadena B, insertándolos en plásmidos bacterianos junto al gen de la β-galactosidasa. Las proteínas de fusión obtenidas se tratan con bromuro de cianógeno (BrCN) para liberar las cadenas A y B, las cuales posteriormente se purifican y se unen químicamente mediante puentes disulfuro.

Otras Aplicaciones Biosanitarias

• Obtención de vacunas
• Diagnóstico de enfermedades genéticas
• Diagnóstico de enfermedades infecciosas
• Terapia génica