Microbiología: Técnicas de PCR, Crecimiento Microbiano, Taxonomía, Arqueas, Bacterias, Virus y Hongos

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y electroforesis

La PCR permite ampliar o copiar fragmentos de ADN.

Componentes de la reacción

• ADN molde
• Nucleósidos (desoxirribonucleótidos)
• Cebadores (primers)
• ADN polimerasa termoestable (tag polimerasa)

Condiciones del termociclador

1. Desnaturalización inicial: 95 °C durante 3 a 5 minutos.
2. Ciclos (25-30 veces):
   • Desnaturalización: 95 °C durante 30 s a 1 min (3,5 min en la primera etapa)
   • Anillamiento (annealing): 55 °C durante 1 min
   • Extensión: 72 °C durante 1 min
3. Extensión final: 72 °C durante 7 minutos.

Durante la desnaturalización se separan las dos hebras de ADN, dejando a la vista los nucleótidos.

Electroforesis

La electroforesis sirve para separar y visualizar el ADN. Los fragmentos se distribuyen a distintas alturas según su peso molecular.

Metabolismo y obtención de energía

El catabolismo consiste en la degradación de moléculas complejas para obtener energía química que satisface las necesidades celulares. El metabolismo engloba el catabolismo y el anabolismo.

Clasificación según la fuente de energía y de carbono

• Fotoautótrofos: captan energía luminosa y utilizan el carbono atmosférico (CO₂) como fuente de carbono.
• Quimioautótrofos: convierten una fuente de energía externa en energía interna y captan CO₂ atmosférico.
• Quimioheterótrofos: convierten una fuente de energía externa en energía interna y captan carbono orgánico de otros microorganismos.

Crecimiento y cultivo microbiano

Métodos de valoración del crecimiento

• Cámara de recuento: se deposita una gota de suspensión y se cuentan las partículas teniendo en cuenta la altura y el volumen.
• Azul de metileno: permite diferenciar células vivas de muertas. Las células muertas se tiñen de azul intenso.
• Contador Coulter: consiste en un capilar estrecho por el que pasan las células viables. En la entrada hay 2 electrodos y 1 sensor que detecta células vivas y muertas.
• Recuento de viables mediante siembra en superficie: se distribuyen los individuos en un medio de cultivo. Se siembra 1 ml de suspensión en placa, se vierte el medio de cultivo a 50 °C y se obtiene la confluencia de colonias.
• Turbidimetría: mide la turbidez del cultivo.

Sistemas de cultivo continuo

Se distinguen dos clases: quimiostato y turbidostato. En ambos se puede regular la entrada de nutrientes.

Factores ambientales que influyen en el crecimiento

• Temperatura: cada microorganismo tiene su propio rango.
• pH
• Agua
• Oxígeno: aerobios, microaerófilos y anaerobios.
• Luz: normalmente perjudicial.
• Osmosis: halófilos (con sales) y sacarófilos (con azúcar).

Curvas de crecimiento

Agentes antimicrobianos

• Bactericida: mata a las células, pero no produce lisis o ruptura.
• Bacteriostático: inhibe el crecimiento, pero no produce la muerte.
• Bacteriolítico: induce la muerte mediante lisis de la célula.

Tipos de medios de cultivo

• Medios ricos y enriquecidos: para el cultivo y mantenimiento de microorganismos.
  • Mueller-Hinton: bueno para bacterias de crecimiento rápido; no es adecuado para conservar cepas.
  • Sabouraud: para levaduras; puede ser selectivo añadiendo un agente selectivo.
  • Agar nutritivo: medio general.
• Medios selectivos: favorecen el desarrollo del microorganismo que se desea aislar.
  • MacConkey: incorpora sales biliares y cristal violeta, que son antisépticos; facilita el crecimiento de bacterias Gram negativas.
  • Manitol o Chapman: altas concentraciones de NaCl; favorece el crecimiento de cocos Gram positivos.
• Medios diferenciales: permiten identificar ciertas propiedades fisiológicas y bioquímicas, como las fuentes de nitrógeno.

Clasificación, nomenclatura e identificación

La taxonomía clasifica, nomenclatura e identifica a los seres vivos. Sus pasos son: 1. especie; 2. claves dicotómicas; 3. reino, filo, clase, orden, familia, género y especie.

Tipos de taxonomía

• Clásica: basada en caracteres fenotípicos (morfología, nutrición, tasa de crecimiento, flagelación, patogenicidad y sensibilidad a antibióticos) y caracteres genotípicos (desnaturalización y cromatografía).
• Numérica: considera todos los caracteres por igual. Utiliza coeficientes de semejanza y similitud (a + d), donde a son caracteres presentes en ambas cepas, d caracteres ausentes en ambas, y se comparan los caracteres presentes solo en una cepa.
• Polifásica: integra caracteres fenotípicos, genéticos y filogenéticos. Emplea árboles filogenéticos, extracción de ADN y amplificación por PCR del gen del ARNr.

Arqueas y bacterias

Diferencias entre arqueas y bacterias

1. Las arqueas carecen de ácido murámico en sus paredes celulares.
2. Poseen lípidos de membrana con cadenas alifáticas unidas por enlaces éter. Algunas tienen una monocapa lipídica.
3. La ARN polimerasa presenta características propias.
4. Tienen ribosomas de composición y forma diferentes a los de las bacterias (A y B), de tamaño similar, 70S.

Características de las arqueas

• Las metanógenas y las reductoras de sulfato tienen cofactores exclusivos.
• Presentan genoma circular, con genes y fragmentos característicos.
• La pared celular no contiene péptidos.
• Tienen rutas metabólicas diferentes para la fijación del CO₂ y la síntesis de metano.

Taxonomía de las arqueas

• Crenarchaeota: hipertermófilas, metabolizan azufre; relojes evolutivos lentos. Orden Thermoproteales.
• Euryarchaeota: ambientes extremos; incluye metanógenas y halobacterias aerobias. Algunas son hipertermófilas.
• Korarchaeota: descubiertas en el manantial de Yellowstone. Viven a altas temperaturas y producen chaperoninas que reconfiguran proteínas desnaturalizadas y estabilizan núcleos hidrofóbicos.

Aplicaciones industriales de las arqueas

Sus enzimas son ideales para la biocatálisis en procesos industriales: detergentes, azúcares, minería y antibióticos.

Bacterias

Son fototrofas y, las especies termófilas, las más antiguas.

• Filo Aquificae: utilizan H₂ para producir energía.
• Proteobacterias: fototrofas, heterótrofas y quimiolitótrofas. Son importantes en medicina, industria e investigación. Según su ARNr se dividen en:
  • Alfa (α): bacterias púrpuras del azufre, rizobacterias y agrobacterias (Rhizobium, fijadoras de nitrógeno).
  • Beta (β): utilizan sustancias procedentes de la descomposición de materia orgánica de su hábitat (Hydrogenophilales, Neisseriales).
  • Gamma (γ): fotosintéticas y oxidadoras de azufre; incluye Pseudomonadales y Enterobacteriales.
  • Delta (δ): bacterias depredadoras de Gram negativas; secretan enzimas digestivas y antibióticos que lisan o matan a sus presas.
  • Épsilon (ε): Campylobacterales; causan aborto en ganado.
• Firmicutes: Gram positivas de bajo contenido G-C. Incluye las clases Clostridia y Bacilli (orden Lactobacillales); Clostridium botulinum puede infectar heridas abiertas.
• Actinobacterias: Gram positivas de alto contenido G-C. Presentan hifas y producen esporas asexuales. Son importantes en la mineralización de la materia orgánica. Incluyen Corynebacterineae y Micrococcineae.

Virus

Los virus son parásitos intracelulares obligados, de tamaño ultramicroscópico, acelulares e inactivos fuera del hospedador. Tienen una estructura formada por una cápside con ácido nucleico. No producen energía.

Clasificación

1. Según Baltimore: ADN+/-, ARN+/-, ARN-, ARN+ con transcripción inversa, etc.
2. Según la presencia o no de envoltura.
3. Según su morfología, su hospedador y su arquitectura genética (helicoidal, icosaédrica y compleja).

Ciclo de infección vírica

1. Absorción
2. Penetración
3. Descapsidación
4. Replicación
5. Ensamblaje de los componentes víricos
6. Liberación

Hongos

Estructuras

• Reproducción sexual: zigosporas, basidiosporas y ascomas.
• Reproducción asexual: conidióforos y conidios; esporangióforos y esporangios.
• Estructuras de resistencia: clamidosporas y esclerocios.

División según la reproducción sexual

• Ascomycota: producen ascomas y ascosporas. Ejemplos: Fusarium, Aspergillus y Penicillium.
• Basidiomycota: producen basidiosporas.
• Chytridiomycota y Zygomycota.