Proteómica y Espectrometría de Masas: Técnicas, Cromatografía y Ionización de Proteínas

Conceptos básicos de proteómica

PROTFUNMAD: especifica la función y el lugar de acción. Activa la maduración y el desarrollo orgánico. Interacciona con elementos moleculares.

Proteoformas: variante de una misma proteína por modificaciones postraduccionales (adición de un grupo funcional a la secuencia peptídica de la proteína, por ejemplo metilación, acetilación o fosforilación).

Error sistemático: resultados dañados por factores externos y no relevantes en el estudio.

Punto isoeléctrico: pH en el que la carga neta de la proteína es igual a 0.

Técnicas cromatográficas

La cromatografía separa los componentes de una mezcla según su interacción con la fase estacionaria y la fase móvil. Los principales mecanismos son:

• Adsorción: compuestos polares no iónicos se adhieren a la superficie de la fase estacionaria.
• Intercambio iónico: atracción entre iones de carga opuesta; separa compuestos aniónicos y catiónicos.
• Partición: depende de la solubilidad relativa del analito en la fase móvil y en la estacionaria.
• Exclusión: separa moléculas por tamaño (tamizado molecular).
• Afinidad: interacción específica con un cuerpo o ligando particular.

Componentes de la cromatografía

• Fase móvil: solvente que se mueve a través de la columna.
• Fase estacionaria: sustancia fijada dentro de la columna.
• Eluyente: fluido que entra en la columna.
• Eluato: fluido que sale de la columna y se recolecta.
• Elución: proceso de lavado de un componente por la columna usando un solvente adecuado.
• Analito: componentes individuales de una mezcla que deben separarse y analizarse.

HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) es un método común para la purificación de proteínas.

Resultados de referencia

Ejemplos de proteínas utilizadas: RibonucleasaA, Citocromo C, Albúmina sérica bovina, Mioglobina, Enolasa y Fosforilasa.

Espectrometría de masas

La espectrometría de masas cuantifica el material identificando los componentes de cada muestra. Su flujo general es: Inlet → Source → Analyzer → Ion Detector → Data System → Data Output.

Componentes principales

• Introducción de muestra (Inlet): líquida, sólida o gaseosa.
• Detector: copa de Faraday, placa de microcanales, multiplicador de electrones y fotomultiplicador.
• Analizador de masas: cuadrupolo, TOF (tiempo de vuelo) y trampa de iones.

Métodos de ionización

ESI, EI, FAB, CI, FIM, FDM, MALDI, PD y TI.

• Líquido (ESI, electrospray): produce iones usando un electrospray donde se aplica voltaje al líquido, creando un aerosol.
• Sólido (MALDI, ionización láser asistida por matriz): la energía láser es absorbida por la matriz, creando iones de moléculas grandes sin fragmentación.

TOF: combina alta sensibilidad y alta precisión. MALDI-TOF es una técnica acoplada muy utilizada.

Tipos de proteómica

La proteómica puede ser estructural, cuantitativa o funcional, y se clasifica según la estrategia de digestión:

• Top-down: identifica y cuantifica proteoformas únicas mediante el análisis de proteínas intactas (10 kDa < Mw < 50 kDa).
• Middle-down: tras una digestión enzimática parcial, utiliza proteasas específicas para producir péptidos de rango medio (2.0 kDa < Mw < 20 kDa).
• Bottom-up: identifica proteínas y sus características mediante la secuenciación de péptidos producidos por digestión proteolítica (péptidos de aproximadamente 0.5 kDa < Mw < 3.0 kDa).

Otras técnicas y herramientas

• NMR y cristalografía de rayos X.
• MS/MS y MS en tándem: utilizados en la fragmentación de péptidos.
• Electroforesis: utilizada para separar moléculas según su tamaño (ADN y proteínas).
• Cromatografía: herramienta terapéutica contra el cáncer.
• Espectrometría: herramienta analítica que determina la masa y la carga de proteínas y péptidos.
• MALDI-TOF: herramienta acoplada a una fuente de ionización por electrospray de nanoflujo.
• Punto isoeléctrico: valor que indica la carga neta cero de las proteínas bajo un pH determinado.
• Tinciones para geles de poliacrilamida: azul de Coomassie, nitrato de plata y SYPRO Ruby.
• HPLC: instrumento más usado en cromatografía.
• Objetivo de la fragmentación peptídica: obtener información detallada de la secuencia de péptidos de una proteína.
• Analizador TOF: emplea el tiempo de vuelo de los iones para diferenciar masas y determinar la secuencia peptídica mediante huella digital peptídica.
• Analizador Orbitrap: determina la frecuencia de rotación de los iones en el analizador y, mediante herramientas matemáticas, la masa y la carga de los péptidos.