Pruebas bioquímicas en microbiología: TSI, LIA, citrato, indol, catalasa y oxidasa

PR8: Pruebas Bioquímicas

Las pruebas bioquímicas permiten identificar cualquier medio que contenga uno o varios sustratos específicos, a veces con indicador de pH in situ, que pone de manifiesto la capacidad de una bacteria para degradar los sustratos.

Prueba TSI (Triple Sugar Iron)

Sirve para detectar la fermentación de hidratos de carbono. El medio contiene:

• Glucosa 0,1%
• Lactosa 1%
• Sacarosa 1%
• Peptona
• Indicador rojo de fenol
• Sulfato de hierro, para evidenciar la formación de H₂S

Procedimiento: siembra por picadura y estría. Incubar a 37 °C durante 24 horas.

Prueba LIA (Agar Lisina Hierro)

Permite evidenciar la descarboxilación del aminoácido lisina, su desaminación y la producción de ácido sulfhídrico (H₂S).

Procedimiento: siembra por picadura y estría. Incubar 24 horas a 37 °C.

Prueba del Citrato de Simmons

Permite comprobar la capacidad de un microorganismo de usar el citrato como fuente exclusiva de carbono.

Prueba del Indol

Detecta la liberación de indol en el cultivo bacteriano. La liberación se debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante la enzima triptonasa.

Procedimiento: cultivar la bacteria durante 24-48 horas en caldo triptona con NaCl al 0,5%. Para detectar el indol se añaden 5 gotas del reactivo de Kovács. Si se produce un anillo de color rojo en la superficie del caldo, la prueba es positiva.

Prueba de la Catalasa

La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.

Procedimiento: utilizar una colonia aislada sobre un portaobjetos con aguja de inoculación y añadir 2 gotas de H₂O₂.

Prueba de la Coagulasa

La coagulasa es una proteína de composición química desconocida, con actividad semejante a la protrombina, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina, produciendo un coágulo visible en el sistema de prueba apropiado.

Prueba de la Oxidasa

Sirve para determinar la presencia de la enzima oxidasa. La reacción positiva se debe a la presencia del sistema citocromo oxidasa, que activa la oxidación del citocromo.

Pruebas Serológicas

Permiten estudiar la reacción antígeno-anticuerpo in vitro, además de desarrollar y controlar métodos más sensibles, específicos y sencillos que permitan demostrar esta reacción.

Vía Anfibólica

Es una vía mixta, catabólica y anabólica, como el ciclo de Krebs (CK), que genera energía y poder reductor.

Descarboxilación y Desaminación de la Lisina

• Descarboxilan la lisina: Serratia, Salmonella, E. coli (negativo en la desaminación)
• Desaminan la lisina: Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Morganella spp.

PR7: Métodos de Siembra e Inoculación

Los aspectos más importantes son:

Siembra de inóculo en medio líquido

Con asa de siembra se carga con la muestra problema, en condiciones de esterilidad, y se adiciona al medio líquido agitándola. El isopo es igual.

Siembra de inóculo sólido en placa Petri

A) Técnica de Barry

Se toman 20 a 25 ml de medio de cultivo a 45-50 °C, se adiciona la cantidad de inóculo, se homogeneiza y después se vierte en la placa Petri para dejar solidificar.

B) Muestra líquida en placa con asa de Drigalski

Se adiciona al medio sólido un inóculo que puede oscilar en 1 ml con pipeta y se extiende con asa estéril. Se usa en recuento viable y antibiograma.

C) Agotamiento: aislamiento por estría

Con asa de siembra flameada, se toma la cantidad de muestra problema, se deposita en un extremo superior y se hace un movimiento en zigzag de extremo a extremo sin levantar el asa hasta concluir.

D) Agotamiento: aislamiento por estría múltiple

Se toma la muestra con asa de siembra estéril y se deposita en el extremo superior de la placa, extendiendo de extremo a extremo solo en la parte superior. Flamear el asa y girar ligeramente la placa; repetir el proceso anterior, volver a flamear sin coger muestra y repetir la operación hasta 4 o 5 veces, teniendo en cuenta que el último tramo se efectuará hacia el interior de la misma.

Resultado: colonias cada vez más separadas, como consecuencia de que la muestra se va arrastrando y separando.

E) Técnica de 4 cuadrantes

Dibujar una línea perpendicular que cruce el centro de la placa para dividirla en 4. Tomar con asa estéril una cantidad de inóculo y adicionarla en un extremo en forma de zigzag, sin flamear, en todos los cuadrantes. En el último cuadrante se obtiene la colonia más aislada.

F) Técnica de giro

Tomar el inóculo con asa y sembrar por estría la mitad superior sin flamear. Girar 90° y volver a sembrar una segunda vez, así sucesivamente hasta completar la siembra. No es utilizada porque no permite un buen aislamiento.

G) Siembra por dilución

Se dispondrá la bacteria de un tubo con medio de cultivo específico. Se adiciona la cantidad de muestra sólida o líquida en el tubo inicial, sabiendo la cantidad añadida, y se agita hasta homogeneizar. Con pipeta estéril se toma una cantidad exacta y se transfiere al segundo tubo, que se homogeneiza. Repetir la operación con los tubos 10^-3 y 10^-4. Inocular en placa de cultivo una cantidad exacta de inóculo (1 ml), extender con asa de Drigalski e incubar a 37 °C durante 24 horas.

Métodos de siembra en tubo

• A) Estría en tubo con medio sólido: se toma con asa y se siembra en la superficie del medio mediante movimientos ascendentes en zigzag hasta completar la superficie. Se usa para conservar cepas durante largos periodos.
• B) Picadura: consiste en introducir el asa en el medio de cultivo hasta el fondo, en posición central. Se usa para sembrar medios de cultivo semisólidos.
• C) Siembra por picadura y estría: combinación de las dos técnicas anteriores. Se utiliza cuando el medio es sólido e inclinado. Primero se realiza la picadura y posteriormente la estría. Ejemplo: medio de oxidación-fermentación de Hugh-Leifson.

Ejemplos de siembra: prueba del medio KIA-LIA y prueba del medio de citrato.

PR6: Medios de Cultivo

Definición

Un medio de cultivo es un sustrato estéril que reúne características físicas y químicas que permiten el desarrollo y crecimiento de gérmenes. Debe contener C, N, S, P, calcio, hierro y oligoelementos como manganeso, molibdeno, zinc y cobre.

Es el sustrato sólido o líquido donde crecen y se multiplican los microorganismos, con el objetivo de realizar su aislamiento, identificación y estudio.

Temperaturas de crecimiento:

• Psicrófilo: 0 a 15 °C
• Mesófilo: 20 a 43 °C

Clasificación

A) Según el estado físico

• Medio líquido: no contiene agar. Ejemplos: caldo nutritivo, agua peptonada.
• Medio sólido: contiene un agente solidificante como agar en una concentración superior al 1%, como la mayoría de medios de cultivo. Ejemplos: agar nutritivo, agar sangre, agar chocolate.
• Medio semisólido: contiene agar en una concentración menor al 1% u otro solidificante como la gelatina.

B) Según su naturaleza

• Medio natural: extraído de la naturaleza conservando su estado original. Ejemplos: leche de vaca, infusión general.
• Medio artificial: elaborado de forma artificial, que se encuentra deshidratado. Ejemplos: agar nutritivo, agar soya.

C) Según su finalidad

• Medio basal: posee en su constitución elementos básicos y permite el desarrollo de una gran variedad de microorganismos poco exigentes. Ejemplo: agua peptonada.
• Medio de enriquecimiento: posee la adición de uno o más sustancias nutritivas que permiten el desarrollo de otros. Ejemplos: agar sangre y chocolate.
• Medio diferencial: posee una sustancia indicadora que permite diferenciar microorganismos a través de reacciones bioquímicas gracias al metabolismo bacteriano. Ejemplos:
  • Agar TSI: permite saber si el microorganismo utiliza lactosa, sacarosa o glucosa, y si produce H₂S.
  • LIA: permite saber si el microorganismo descarboxila o desamina el aminoácido lisina.
  • Citrato de Simmons: indica si el microorganismo usa citrato como fuente de carbono.
  • Agar EMB: se usa para diferenciar enterobacterias.
• Medio de identificación: puede tener varias características que los diferencian, y sirve para identificar el crecimiento y las características de algún tipo de microorganismo. Ejemplos: peptona, urea, glucosa.
• Medio selectivo: medio cuya composición contiene una sustancia inhibidora que permite el crecimiento de un solo tipo de microorganismo, inhibiendo el crecimiento del resto. Ejemplos: agar SS, agar Rothe.

Constituyentes del medio de cultivo

Agua, peptona, extracto e hidratos de carbono.

Requerimientos de oxígeno

• Aerobio obligado: requiere oxígeno para poder respirar; usa el oxígeno para oxidar el sustrato y obtener energía. Ejemplos: Clostridium, Actinomyces.
• Anaerobio facultativo: bacteria que puede desarrollarse en presencia o ausencia de oxígeno. Ejemplos: E. coli, Salmonella.
• Anaerobio estricto: el oxígeno le resulta tóxico. Algunos realizan fermentación. Ejemplo: Propionibacterium.
• Anaerobio aerotolerante: no necesita oxígeno, y tampoco le perjudica. Todos los microorganismos son fermentadores. Ejemplo: Streptococcus mutans.
• Microaerófilo: microorganismo que requiere oxígeno para sobrevivir, pero necesita un entorno con un nivel más bajo de oxígeno. Ejemplos: Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae.

pH

El pH mide la acidez o alcalinidad y va desde 0 a 14. Ejemplos: jugo ácido (pH 2), agua de mar (pH 8).

• Acidófilo: microorganismo que se desarrolla entre pH 1,0 y 5,0. Ejemplos: Clostridium, E. coli.
• Neutrófilo: se desarrolla entre pH 5,5 y 8,5. Ejemplos: Staphylococcus aureus, Nitrosomonas spp.
• Alcalófilo: se desarrolla a pH 9,0 y 10. Habita en lagos sódicos. Ejemplos: Bacillus alcalophilus y B. spirulina.

Medio sintético

Es el medio en el que se conocen todos los componentes. Ejemplos: agar nutritivo, medio blando, caldo nutritivo.

PR5: Esterilización y Métodos Químicos

Definiciones

• Agente quimioterapéutico: agente químico antibiótico que se usa para tratar enfermedades infecciosas.
• Germicida: agente químico que mata microorganismos.
• Gemiostático: agente químico que inhibe el crecimiento microbiano.
• Desinfectante: germicida que se usa sobre superficies inanimadas.
• Antiséptico: germicida que se aplica sobre seres vivos.

Los antisépticos y desinfectantes ejercen diversas funciones, entre ellas su acción como antiséptico (superficie viva) y como desinfectante (inanimado).

Clasificación

A) Antisépticos inorgánicos

• Compuestos halogenados: yodo, cloro y derivados.
  • Yodóforos: combinaciones de sustancias orgánicas que liberan yodo libre al entrar en contacto con el tejido. Son los más empleados.
  • Cloro y derivados: germicidas muy potentes que actúan sobre bacterias, virus y amebas. Eliminan también esporas y la mayoría de gérmenes en 20 segundos. Son muy irritantes y no se usan en tejido vivo.
• Agentes oxidantes: agua oxigenada y permanganato de potasio.
• Metales pesados: compuestos de mercurio y plata. Se usan muy poco, pues se inactivan rápidamente en presencia de tejido orgánico; además, en soluciones diluidas son bacteriostáticos.

B) Antisépticos orgánicos

• Alcohol: etílico e isopropílico
• Fenol
• Detergente aniónico: jabón
• Detergente catiónico: compuesto de amonio cuaternario

Fenol: no se emplea en la actualidad, siendo más usados sus derivados como los bisfenoles y el cresol.

Detergentes: se caracterizan por ser agentes surfactantes y humectantes con acción germicida sobre microorganismos.

Prueba de sensibilidad (Kirby-Bauer)

Se impregna un disco de papel filtro en diferentes germicidas y, en una placa Petri sembrada con la técnica de Kirby-Bauer, se coloca el disco con pinza. Se incuba a 37 °C durante 24 horas.

• Presencia de halo: sensible al germicida.
• Ausencia de halo: resistente a la acción germicida.

Factores a tener en cuenta

Para elegir un germicida se deben considerar: solubilidad, pH, efectividad sobre metales, actividad con jabón, eficacia y tiempo de contacto.

Clasificación de los germicidas según su acción

• Bactericida: elimina bacterias.
• Bacteriostático: inhibe el crecimiento bacteriano.
• Fungicida: actúa sobre hongos.
• Virucida: actúa sobre virus.

Mecanismos de acción

• Fenol: altera la permeabilidad de la membrana bacteriana mediante el bloqueo de la síntesis de lípidos.
• Compuestos fenólicos: interrumpen la cadena de transporte bacteriana.
• Alcohol: desnaturaliza proteínas en presencia de agua; por lo tanto, su actividad depende de su concentración.
• Peróxido de hidrógeno: altera el ADN debido a radicales hidroxilo.
• Halógenos: precipitan proteínas e inactivan enzimas bacterianas.
• Metales pesados (mercurio): reacciona con grupos sulfhidrilo, provocando inhibición enzimática y alteración patológica de la membrana celular.