Técnicas de cuantificación de proteínas: AQUA, ICAT, iTRAQ y SILAC

La Carbamilación: Un Obstáculo en el Análisis de Proteínas

La carbamilación es una modificación postraduccional que ocurre cuando el ácido isociánico, un subproducto de la degradación de la urea, reacciona de forma no enzimática con el extremo amino terminal de los péptidos. Esta reacción tiene un impacto negativo en las propiedades estructurales y funcionales de las proteínas, acelerando su envejecimiento.

Es crucial evitar la carbamilación, ya que interfiere con la digestión proteolítica por tripsina y la identificación mediante espectrometría de masas. Para prevenirla, se recomienda:

• Utilizar soluciones de urea recién preparadas y desionizadas.
• Mantener temperaturas bajas (nunca superiores a 37°C).
• Trabajar a pH bajo.
• Usar reactivos que eliminen el cianato del medio.
• Emplear buffers con amonio, como el bicarbonato amónico.

Regulación Génica y Vida Media de Proteínas

La vida media de las proteínas y sus correspondientes ARNm varía considerablemente y está influenciada por la función de la proteína y la regulación génica. Los genes que codifican proteínas reguladoras suelen tener una vida media corta tanto para el ARNm como para la proteína, lo que permite una respuesta rápida a los cambios celulares.

Por otro lado, los genes que codifican proteínas implicadas en procesos celulares esenciales, como el metabolismo o la traducción, suelen tener una vida media larga tanto para el ARNm como para la proteína, asegurando una presencia constante de estas proteínas.

Estudio de la Expresión de Genes Relacionados con Proteínas Extracelulares

Para investigar la expresión de genes que codifican proteínas extracelulares, el análisis transcriptómico es la técnica de elección. Esto se debe a que se centra en el análisis del ARN, que tiene una vida media más larga que las proteínas extracelulares, las cuales se degradan rápidamente.

Técnicas de Cuantificación de Proteínas

AQUA (Absolute Quantification of Proteins)

En esta técnica, se sintetizan péptidos específicos de la proteína de interés con una masa ligeramente mayor que sus contrapartes naturales. Estos péptidos sintéticos se añaden a la muestra, actuando como estándares internos. Al comparar la intensidad de los picos de los péptidos sintéticos y naturales en la espectrometría de masas, se puede determinar la cantidad absoluta de la proteína.

ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag)

Este método de marcaje isotópico se utiliza para identificar y cuantificar proteínas, especialmente aquellas de baja abundancia. Se utilizan sondas con isótopos ligeros y pesados para marcar dos muestras diferentes. Tras la digestión y purificación, la comparación de la intensidad de los picos en la espectrometría de masas permite determinar la abundancia relativa de las proteínas en las dos muestras.

ITRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation)

ITRAQ es un método de marcaje isobárico que permite la cuantificación simultánea de proteínas de diferentes orígenes en un solo experimento. Se utilizan etiquetas químicas con diferentes isótopos para marcar las muestras. La espectrometría de masas en tándem se utiliza para identificar y cuantificar las proteínas marcadas, lo que permite comparar su abundancia relativa.

SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture)

En esta técnica, las células se cultivan en medios que contienen aminoácidos marcados isotópicamente. Estos aminoácidos se incorporan a las proteínas durante la síntesis, lo que permite distinguir las proteínas de diferentes muestras mediante espectrometría de masas. La comparación de la intensidad de los picos en los espectros de masas revela la abundancia relativa de las proteínas en las diferentes muestras.