Técnicas de inmovilización enzimática y cinética microbiana: métodos y modelos de crecimiento

Técnicas de Inmovilización y Cinética Microbiana

Técnicas de Inmovilización

Retención física: Atrapamiento (gel-fibra), inclusión en membrana (microencapsulación, reactores de membrana).

Unión química: Unión a soporte (absorción, unión covalente), retículo o cross-linking.

Atrapamiento en Matrices

Inmovilización física dentro de las cavidades interiores de una matriz sólida porosa entrecruzable. Se lleva a cabo mediante suspensiones de la enzima en una solución del monómero. La polimerización se inicia por cambio de temperatura o por reactivos químicos. Pueden ser geles o fibras.

Ventajas:

• Sencillo experimentalmente.
• Requiere poca cantidad de enzimas.
• La enzima no sufre alteraciones en su estructura.

Microencapsulación

Uso de una membrana semipermeable que permite el paso de las moléculas de sustrato y producto, pero no de la enzima. Puede ser permanente (por polimerización) o no permanente (por surfactante). Las microcápsulas tienen un diámetro de 1-100 µm.

Reactores de Membrana

Membranas permeables al producto final, pero no al sustrato inicial, e impermeables a la enzima. Se utiliza una bomba de flujo líquido que atraviesa el reactor.

Metodología: Se inicia la absorción de la enzima sobre la membrana que forma el reactor. La absorción se puede realizar mediante soluciones tamponadas de enzima a través de la membrana, o por contacto continuo de soluciones de enzima con la membrana.

Unión a Soporte

Son muy utilizados. El soporte y el enlace son cruciales para el funcionamiento del biocatalizador. Buscan incrementar la afinidad del sustrato, disminuir la inhibición y ampliar el intervalo de pH.

Soporte: Resistencia mecánica adecuada, fácil separación de medios líquidos para ser reutilizados. Se presentan en cilindros, hojas, fibras y esferas.

Absorción

La enzima se une al soporte sin funcionalización por interacciones iónicas, fuerzas de Van der Waals y puentes de hidrógeno. Factores que influyen: pH, fuerza iónica, diámetro del poro, presencia de iones.

Ventajas:

• Preparación sencilla.
• Bajo costo.
• No hay cambio en la especificidad de la enzima (E).
• Los derivados son estables con H₂O.

Desventajas:

• La unión al soporte es débil.
• Poco estable desde el punto de vista mecánico.

Uniones Covalentes

Es el método de inmovilización más usado en la industria. La base son grupos químicos del soporte para la reacción de ciertos aminoácidos (aa) de las proteínas. Los aminoácidos más empleados son lisina, cisteína, tirosina e histidina.

Ventajas:

• Manipulación sencilla.
• Carga de la enzima (E) constante luego de la inmovilización.
• Resistencia a la desactivación por temperatura (T°), disolventes orgánicos o pH.

Reticulado (Cross-linking)

Entrecruzamiento. Uniones irreversibles que resisten condiciones de temperatura y pH, y la acción de proteasas.

Cinética Microbiana

Objetivo: Cuantificación del crecimiento celular a través del tiempo.

Modelos de Crecimiento Microbiano

• Estructurado y no estructurado: El modelo estructurado se usa para sistemas formados por compartimentos de crecimiento celular.
• Segregado: Sistema de un conjunto de células con características individuales.

Crecimiento Balanceado: Define el crecimiento celular y controla el sustrato limitante. La aproximación se define como la "célula promedio", donde todas las células son iguales y se comportan igual. La población celular es no segregada y no estructurada.

Tipos de Cultivos

• Continuos: Caudal constante de entrada y salida. La mezcla en el reactor hace que las concentraciones en su interior sean homogéneas e iguales a la corriente de salida.
• Discontinuo: La célula crece dentro del reactor y no puede reproducirse. El crecimiento llega hasta una limitación. Las fases son: latencia, crecimiento exponencial, estacionaria, declinación, crecimiento críptico. En la fase exponencial aparecen limitaciones y la fase estacionaria es casi nula.

Tiempo de duplicación (td): Relacionado con la velocidad específica de crecimiento (µ).

Modelo de Monod: Describe el crecimiento celular en función de la disponibilidad del sustrato limitante. Se expresa como la dependencia de la velocidad específica de crecimiento.