Técnicas de Laboratorio para el Estudio del ADN: Enzimas de Restricción, Plásmidos pBR322 y PCR

Las técnicas de laboratorio desarrolladas hasta la fecha para el estudio del ADN presentan una infinidad de variantes. Entre estas tenemos: enzimas de restricción, plásmido pBR322 y la reacción en cadena de la polimerasa.

Enzimas de Restricción

Una enzima de restricción es una enzima que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restricción (4 y 12 pares de bases), o en un sitio no muy lejano a este, dependiendo de la enzima.

El mecanismo de corte de ADN se realiza a través del rompimiento de dos enlaces fosfodiéster en la doble hebra, dando lugar a dos extremos de ADN, que pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o cohesivos/escalonados. Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas.

Plásmidos pBR322

Dentro del grupo de vectores están los plásmidos pBR322. Se replican independientemente del ADN. Uno de los plásmidos usados como vector de clonación contiene 4361 pb. Contiene dos genes de resistencia a antibióticos: uno confiere resistencia a ampicilina (Amp^r) y el otro a tetraciclina (Tet^r).

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) sirve para amplificar un fragmento de ADN. Su utilidad es que, tras la amplificación, resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad. Utiliza ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. La PCR está automatizada mediante un aparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción.

Componentes Necesarios para la PCR

• Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs): el sustrato para polimerizar nuevo ADN.
• Dos cebadores (o primers): oligonucleótidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos, normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reacción. Delimitan la zona de ADN a amplificar.
• Iones divalentes: se suele usar magnesio (Mg²⁺), agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl₂), o algún otro catión divalente. Actúan como cofactores de la polimerasa.
• Iones monovalentes: como el potasio.
• Una solución tampón: que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento del ADN polimerasa.
• ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas: con temperatura óptima alrededor de 70ºC (la más común es la Taq polimerasa).
• ADN molde: que contiene la región de ADN que se va a amplificar.
• Termociclador: el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.