Espectrometría de masas y cromatografía: técnicas de separación y detección

Resumen

El texto resume técnicas analíticas usadas en química clínica: la espectrometría de masas (ionización, separación y detección), la fotometría de reflectancia en química seca, la refractometría y la polarimetría. Describe también tres cromatografías: de exclusión por tamaño, de intercambio iónico y de afinidad, explicando su principio de separación.

Puntos clave

La espectrometría de masas consta de ionización, separación de iones según su relación masa/carga y detección de sus abundancias.
En química seca la medida puede ser colorimétrica, potenciométrica o enzimática.
La refractometría se aplica a la medición de compuestos en sangre, plasma y orina.
La polarimetría se basa en la desviación del plano de la luz polarizada por moléculas ópticamente activas como glúcidos, aminoácidos y proteínas.
En la cromatografía de exclusión por tamaño las moléculas eluyen de forma inversamente proporcional a su masa molecular.
La cromatografía de intercambio iónico separa por carga, y la elución progresiva se logra aumentando la fuerza iónica o el pH de la fase móvil.
La cromatografía de afinidad separa proteínas por su unión específica a ligandos de la matriz, como anticuerpos.

Ponte a prueba

Técnicas Espectrométricas No Espectroscópicas: Espectrometría de Masas

La Espectrometría de Masas se basa en tres procesos fundamentales:

IONIZACIÓN: Transformación de las muestras en iones.
SEPARACIÓN: Separación de los iones resultantes de acuerdo con su relación masa/carga.
DETECCIÓN: Medición de las abundancias de los iones.

Fotometría de Reflectancia y Química Seca

Existen varios tipos de medición en Química Seca:

COLORIMÉTRICA: La medida se produce por cambio de color cuando termina la reacción con el reactivo dentro del soporte.
POTENCIOMÉTRICA: Se mide la diferencia de potencial con un ion selectivo.
ENZIMÁTICA: La lectura se hace en varios puntos durante una reacción catalizada por una enzima. De este modo podemos medir la actividad enzimática.

Aplicaciones de la Refractometría

La refractometría se utiliza para la medición de compuestos en sangre, plasma y orina.

Polarimetría

Fundamento

Se basa en la desviación del plano de luz polarizada por parte de las moléculas ópticamente activas.

Aplicaciones

Las moléculas biológicas ópticamente activas son los glúcidos, los aminoácidos y las proteínas.

Se determina no solo de forma cualitativa; si se realizan las rectas de calibrado se puede determinar cuantitativamente su concentración.

Cromatografía de Exclusión por Tamaño (SEC)

Se utilizan microesferas porosas formadas por un entramado tridimensional de fibras de polímeros naturales como la agarosa. Los espacios entre estas fibras formarán los poros.

Las moléculas de menor tamaño entran por los poros de las microesferas y son retenidas en el interior de la columna. Las de mayor tamaño no pueden entrar en las esferas y saldrán más rápido de la columna.

Este principio de separación se llama Exclusión Molecular, y hace que las moléculas eluyan de forma inversamente proporcional a su masa molecular.

Cromatografía de Intercambio Iónico (IEC)

Las moléculas se separan por su carga. La matriz que se utiliza es una molécula catiónica o aniónica, que atrae a las moléculas con carga opuesta, en mayor medida cuanto mayor sea su carga.

Para conseguir la elución progresiva de las moléculas según su carga se suele aumentar la fuerza iónica o el pH de la fase móvil.

Cromatografía de Afinidad (AC)

Las proteínas se separan en base a su afinidad de unión específica a los ligandos unidos a la matriz de la columna. Una columna de afinidad puede retener específicamente a una o varias moléculas, lo que implica el uso de anticuerpos unidos a la matriz.

Preguntas frecuentes

¿Cómo separa la cromatografía de exclusión por tamaño?

Las moléculas pequeñas entran en los poros de las microesferas y se retienen más tiempo, mientras que las grandes no entran y salen antes de la columna. Por eso eluyen de forma inversamente proporcional a su masa molecular.

¿En qué se basa la cromatografía de intercambio iónico?

Separa las moléculas por su carga, mediante una matriz catiónica o aniónica que atrae las moléculas de carga opuesta. Para eluirlas progresivamente se aumenta la fuerza iónica o el pH de la fase móvil.

¿Qué principio usa la polarimetría?

Se basa en la desviación del plano de la luz polarizada por moléculas ópticamente activas. Con rectas de calibrado puede determinarse también su concentración.