¿Por qué la Taq polimerasa es adecuada para la PCR?

Porque su temperatura óptima de actividad es alta (70-75ºC), lo que permite hibridar los cebadores a temperaturas elevadas, y mantiene su actividad tras incubaciones prolongadas a 95ºC.

¿Qué diferencia hay entre una polimerasa con y sin actividad correctora?

Las que tienen actividad exonucleasa 3'-5' pueden eliminar nucleótidos mal incorporados y son más fieles. Las que carecen de ella, como la Taq polimerasa, no corrigen errores.

¿Qué función tienen los cebadores en la PCR?

Son oligonucleótidos que se hibridan con secuencias diana del ADN molde, sirven de punto de inicio para la polimerasa y delimitan el fragmento que se amplifica.

Técnicas de PCR: componentes de la mezcla, polimerasas termoestables y qPCR

Resumen

Ejercicios sobre la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): las características de las ADN polimerasas termoestables, la diferencia entre enzimas con y sin actividad correctora, y la función de cada componente de la mezcla de reacción. Incluye también cuestiones sobre la PCR a tiempo real (qPCR), el significado del Cp y la curva de fusión.

Puntos clave

Una ADN polimerasa apta para PCR debe tener una temperatura óptima alta (70-75ºC) y resistir incubaciones prolongadas a 95ºC.
La temperatura de extensión debe ser superior a la de hibridación de los cebadores para asegurar la especificidad.
La Taq polimerasa carece de actividad exonucleasa 3'-5' y tiene una tasa de error de aproximadamente 1 por cada 100.000 nucleótidos.
Las polimerasas con actividad correctora poseen exonucleasa 3'-5', que elimina nucleótidos mal apareados (proofreading).
El Mg²⁺ es un cofactor imprescindible para la actividad catalítica de la ADN polimerasa.
En qPCR, a mayor concentración inicial de ADN molde, menor es el Cp.

Ponte a prueba

Las Técnicas de PCR

1. Sobre las ADN Polimerasas Termoestables

a) Indica las dos características principales que debe tener una ADN polimerasa para que se pueda utilizar en PCR y por qué.

Realizan su actividad polimerasa a una **temperatura óptima** comprendida entre los 70ºC y 75ºC, lo que permite hibridar los **cebadores** al **ADN molde** a temperaturas realmente elevadas. Esto establece condiciones de **alta rigurosidad** que maximizan la **especificidad de la reacción**.
Tienen capacidad de mantener su **actividad polimerasa** tras tiempos prolongados de incubación a 95ºC, lo que garantiza que la enzima no se inactivará durante la fase de **desnaturalización** del ADN.

b) Explica la diferencia entre una ADN polimerasa con actividad correctora y otra sin actividad correctora.

ADN Polimerasa sin actividad correctora: Poseen **actividad exonucleasa 5'-3'**, pero **carecen de actividad exonucleasa 3'-5'**. Esto significa que no son capaces de corregir errores (eliminar nucleótidos mal incorporados). Un ejemplo es la **Taq polimerasa**, que tiene una tasa de error de aproximadamente 1 por cada 100.000 nucleótidos incorporados.
ADN Polimerasa con actividad correctora: Poseen **actividad exonucleasa 5'-3' y actividad exonucleasa 3'-5'**. Esta última les confiere la capacidad de **corrección de errores** (proofreading), eliminando nucleótidos mal apareados y resultando en una mayor fidelidad de la replicación.

c) Una ADN polimerasa tiene una temperatura óptima de polimerización de 42ºC y mantiene su actividad tras 2h a 100ºC, ¿puede usarse esta enzima en la PCR? Razona.

No, **no puede usarse en la PCR**. La fase de extensión debería realizarse a 42ºC, y a esa temperatura, los **cebadores** hibridarían inespecíficamente, dando lugar a múltiples **productos inespecíficos**. La **temperatura de extensión** debe ser siempre superior a la **temperatura de hibridación** de los cebadores para evitar este problema y asegurar la especificidad de la amplificación.

2. Lista de Componentes de una Mezcla Estándar de PCR y su Función

Tampón de Reacción

Aporta la **concentración salina adecuada** y mantiene un **pH óptimo y estable** para la actividad de la ADN polimerasa.

Cloruro de Magnesio (MgCl₂)

El **Mg²⁺** es un **cofactor imprescindible** para la actividad catalítica de la ADN polimerasa.

Desoxirribonucleótidos Trifosfato (dNTPs)

Son los **bloques de construcción** (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) que la ADN polimerasa incorpora para sintetizar la nueva cadena de ADN.

Cebadores (Primers)

Son **oligonucleótidos de ADN** que se hibridan con sus respectivas **secuencias diana** en el ADN molde, formando cortas regiones de doble hélice. A estas regiones se une la ADN polimerasa para iniciar la elongación. Además, **delimitan el fragmento** que se va a amplificar.

ADN Polimerasa Termoestable

Es la **enzima responsable** de la síntesis de los **amplicones**, extendiendo los cebadores mediante la incorporación de los dNTPs presentes en la solución y copiando el ADN molde.

3. Afirmaciones sobre la PCR a Tiempo Real (qPCR)

Completa las siguientes afirmaciones sobre la PCR a tiempo real, seleccionando la opción correcta:

a) Cuando se usan agentes intercalantes:

La fluorescencia **AUMENTA** durante la fase de **EXTENSIÓN**.

b) Cuando se utilizan sondas de hidrólisis o sondas TaqMan:

La fluorescencia **AUMENTA** durante la fase de **EXTENSIÓN**.

c) Cuando se utilizan balizas moleculares:

La fluorescencia del **fluoróforo (NOTIFICADOR)** **AUMENTA** al unirse a la secuencia diana, separándose del **quencher**.

d) Cuando se utilizan sondas FRET:

La transferencia de energía ocurre durante la **HIBRIDACIÓN** de las sondas adyacentes, donde el **fluoróforo (NOTIFICADOR)** transfiere energía al **quencher**.

4. Verdadero o Falso (V/F)

Indica si las siguientes afirmaciones son Verdaderas (V) o Falsas (F). Razona las falsas.

a) En la qPCR, el punto de corte (Cp o Ct) es el ciclo en el que la señal de fluorescencia supera el umbral de detección.

Verdadero (V)

b) El Cp de una muestra es directamente proporcional a la concentración inicial de ADN molde.

Falso (F). A mayor **concentración inicial** de ADN molde, el **Cp disminuye**, es decir, se necesitan menos ciclos de amplificación para obtener una cantidad de amplicón superior al límite de detección del termociclador.

c) En la curva de picos de fusión generada, la fluorescencia aumenta a medida que el ADN se desnaturaliza.

Falso (F). La **curva de fusión** se realiza con **agentes intercalantes**, que emiten un máximo de fluorescencia cuando todo el ADN está en doble hélice y va disminuyendo a medida que el ADN se desnaturaliza y el agente intercalante se libera.