Secuenciación de Nueva Generación: Métodos y Aplicaciones en Genómica

Secuenciación Masiva (Segunda Generación): Fundamentos y Procesos

La secuenciación masiva, también conocida como secuenciación de segunda generación (NGS, por sus siglas en inglés), permite secuenciar genomas completos de individuos en un tiempo reducido y a un coste significativamente menor.

Fase de Preparación del ADN Molde

El primer paso crucial es la fragmentación al azar del genoma, seguida de la unión de dos adaptadores universales a los extremos de cada fragmento.

• ADN molde de molécula única:
  • Unir covalentemente uno de los cebadores universales.
  • Unir covalentemente los fragmentos de ADN molde.

Amplificación Clonal del ADN Molde

Esta fase busca obtener millones de copias idénticas (clones) de cada fragmento de ADN molde. Se pueden emplear dos métodos principales:

PCR en Emulsión

Se utilizan microesferas recubiertas de uno de los cebadores. El proceso incluye:

1. Los fragmentos de la biblioteca genómica se desnaturalizan y son capturados sobre la superficie de las esferas, capturando cada una un fragmento.
2. Se introducen en un tubo Eppendorf con una mezcla de PCR que contiene el segundo cebador y aceite.
3. Se emulsionan, obteniendo microrreactores individuales donde se lleva a cabo una PCR convencional.
4. Se rompe la emulsión y las esferas se fijan en una superficie o en micropocillos en una placa Picotiter.

PCR en Fase Sólida o PCR Puente

Este método se realiza directamente sobre una superficie sólida:

1. Los fragmentos se desnaturalizan y las cadenas individuales se anclan, quedando cada cadena de ADN molde rodeada de cebadores universales.
2. Se inunda con una mezcla de PCR sin cebadores y se amplifican.

En cada ciclo de PCR, ocurren los siguientes pasos:

• Hibridación: El adaptador del extremo libre de cada fragmento de ADN hibrida con el cebador universal complementario, formando un puente.
• Extensión: Se sintetiza una nueva cadena complementaria.
• Desnaturalización: Las cadenas se separan.

El resultado son miles de copias en un área de aproximadamente 1 µm.

Reacciones de Secuenciación

Una vez amplificados los fragmentos, se procede a la secuenciación. Existen diferentes enfoques:

Terminación Reversible Cíclica

Este método utiliza nucleótidos (dNTPs) marcados con un fluoróforo y bloqueados para impedir la unión de nucleótidos adicionales, actuando como terminadores de cadena. Los pasos son:

1. Incorporación de un terminador reversible marcado.
2. Lectura de la fluorescencia del soporte.
3. Eliminación del fluoróforo y del grupo bloqueante mediante una reacción química, permitiendo el siguiente ciclo.

Pirosecuenciación

La pirosecuenciación se basa en la producción de bioluminiscencia mediante reacciones enzimáticas acopladas a la incorporación de un nucleótido a una cadena en crecimiento. El proceso es:

1. Incubación de la placa con ADN polimerasa y un dNTP específico.
2. Producción y medida de bioluminiscencia con pirofosfato, si el dNTP se incorpora.
3. Eliminación del exceso de dNTP no incorporado para el siguiente ciclo.

Secuenciación de Tercera Generación

Las tecnologías de secuenciación de tercera generación ofrecen ventajas como la lectura de fragmentos más largos y la secuenciación en tiempo real.

Secuenciación Ion Torrent

Este método detecta microvariaciones de pH producidas en una reacción de polimerización cuando se libera un protón al incorporar un nucleótido.

Secuenciación por Nanoporos

Es un método de secuenciación en tiempo real que no requiere reacción de polimerización ni marcajes. Se basa en el uso de biosensores que detectan cambios en la corriente eléctrica al pasar las bases de ADN o ARN a través de un nanoporo.

Secuenciación de ARN

La secuenciación de ARN (RNA-Seq) permite estudiar el transcriptoma de una muestra. Se clasifica en:

• Métodos directos: Secuencian el ARN directamente.
• Métodos indirectos: Requieren la obtención previa de un ADNc (ADN complementario) mediante transcripción inversa.